褪黑素对噪声应激大鼠肝损伤的保护作用及其机制

【摘要】  目的： 探讨褪黑素（MT）对噪声应激大鼠肝损伤的保护作用及可能机制. 方法： 将40只雄性SD大鼠随机分为5组： 空白对照组、模型1组、模型2组、实验1组、实验2组，每组8只. 实验组和模型组分别在应激前30 min腹腔注射MT(15 mg/kg)和等体积生理盐水. 以56式冲锋枪射击时产生的120 dB（A）的脉冲噪声，对实验组及模型组大鼠进行连续噪声刺激. 噪声应激后，观察MT对各组大鼠血浆中皮质醇、超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）以及肝组织匀浆中SOD，MDA的影响. 结果： 肝脏病理检查显示模型组大鼠出现明显的病理性损伤,实验组大鼠损伤程度明显减轻；模型组大鼠血浆皮质醇、血浆及肝组织匀浆的MDA浓度较空白对照组显著升高，血浆及肝组织匀浆SOD活性显著降低(P<0.01)，实验组大鼠血浆皮质醇的浓度、血浆及肝组织匀浆的MDA浓度较模型组显著降低，血浆及肝组织匀浆SOD活性显著升高(P<0.01). 结论： MT能减轻噪声引起的大鼠肝损伤，其机制可能与抑制脂质过氧化反应有关.

【关键词】  褪黑素 噪声 肝/损伤 皮质醇 超氧化物歧化酶 丙二醛

　　0引言

　　研究表明，噪声不仅能够引起记忆力减退，还可以对机体的血液循环系统、内脏器官和中枢神经系统产生危害［1-2］. 目前，国内鲜见对噪声所致肝功能损害的防治报道. 我们观察了MT对噪声应激大鼠肝脏功能的影响，并通过测定大鼠血浆激素浓度的变化探讨其可能发生的机制，为肝功能损害的防治提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康雄性SD大鼠40只，12 wk龄，体质量(280±30) g(第四军医大学实验动物中心提供). 为消除MT分泌的生物节律对实验结果的影响,于每日8∶00AM时开始实验. MT（Sigma公司）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所）；皮质醇测试盒（北京北方伟业有限公司）. XH2060型全自动γ?免疫分析仪(核部西安二六二厂).

　　1.2方法

　　1.2.1动物给药将40只雄性SD大鼠在7 d环境适应期后随机分为5组：空白对照组、模型1组、模型2组、实验1组、实验2组，每组8只，模型组及实验组给予每日120 dB（A）噪声连续应激8 h，第1组应激1 d，第2组应激3 d，每次噪声刺激前30 min根据分组,实验组腹腔注射MT(15 mg/kg)，模型组腹腔注射等量生理盐水.

　　1.2.2枪击噪音应激模型的建立［3］大鼠禁食12 h后置于隔音室内，用56式冲锋枪射击时产生的噪音制成录音，通过扬声器由电脑控制随机播放，扬声器距离大鼠20～30 cm. 采用国营红声器材厂生产的ND2型精密声级计及频谱分析仪分析检测，控制噪音强度为120 dB（A），频率为0.25～4.00 kHz.

　　1.2.3血液中皮质醇含量、SOD活性及MDA含量的测定各组大鼠应激结束后，麻醉，开胸取血4 mL，其中2 mL加入100 g/L乙二胺四乙酸钠30 μL和抑肽酶40 μL的离心管中，混匀，于4℃，3000 r/min离心10 min，离心半径12 cm，分离血浆，-20℃下保存待测定. 采用放射免疫法测定血浆中皮质醇含量. 操作程序严格按照试剂盒及仪器说明书由1人完成检测. 另外2 mL血液于3000 r/min离心10 min，离心半径12 cm，吸取上清液，-20℃下保存待测定. 严格按照试剂盒说明书进行操作，测量SOD活性及MDA含量.

　　1.2.4肝组织匀浆中SOD活性及MDA含量的测定取血后，将大鼠处死，取肝脏组织洗去残血并吸干水分，用天平称取1 g肝脏组织，用生理盐水配置成100 g/L组织匀浆. 于3000 r/min离心10 min，离心半径12 cm，吸取上清液，-20℃下保存待测定. 严格按照试剂盒说明书进行操作，测量SOD活性及MDA含量.

　　1.2.5肝组织的病检测将部分肝组织洗去残血并吸干水分，放入40 g/L甲醛溶液中4℃保存，送第四军医大学西京病理科做病理学切片检查.

　　统计学处理：所有数据均以x±s表示，结果采用SPSS10.0统计软件进行方差分析,均数间的多重比较用LSD?t进行显著性检验.

　　2结果

　　2.1各组大鼠血浆皮质醇的变化空白对照组、模型1组、模型2组、实验1组、实验2组血浆皮质醇浓度分别为（0.95±0.10）,（1.99±0.08）,（2.59±0.09）,（1.27±0.14）,（1.63±0.09）. 模型1组、模型2组大鼠血浆皮质醇均较空白对照组显著升高（P<0.01），实验1组较模型1组显著降低（P<0.01），实验2组较模型2组显著降低（P<0.01）.

　　2.2各组大鼠血浆及肝组织匀浆SOD， MDA的变化模型1组及模型2组显著低于空白对照组（P<0.01，表1），实验1组较模型1组显著升高（P<0.01），实验2组较模型2组显著升高（P<0.01）. 各组大鼠血浆肝组织匀浆MDA水平比较，模型1组及模型2组较空白对照组显著升高（P<0.01），实验1组较模型1组显著降低（P<0.01或0.05），实验2组较模型2组显著降低（P<0.01）.

　　表1MT对噪声应激大鼠血浆肝组织匀浆SOD，MDA的影响（略）

　　bP<0.01 vs 空白对照组； dP<0.01 vs 模型1组； fP<0.01 vs 模型2组.

　　2.3各组大鼠肝脏组织形态学模型组比实验组肝脏组织明显充血水肿，有较多炎细胞浸润，肝小叶结构受到破坏，细胞形态不规则，有部分肝细胞变性（图1）. 其中模型2组较模型1组严重. 实验1组、实验2组肝细胞损伤明显减轻.

　　3讨论

　　应激是机体在受到各种因素刺激时所出现的一些非特异性反应，而下丘脑?垂体?肾上腺皮质激素系统(HPA轴)是应激系统的重要组成部分［4］，机体主要是通过HPA轴来调节机体完成对应激的适应. HPA轴兴奋时，促肾上腺激素释放激素（CRH）合成增加，刺激垂体前叶释放促肾上腺皮质激素（ACTH）进而增加糖皮质激素分泌，血浆皮质激素水平是其最终表现形式. 研究发现，心理应激可导致大鼠血浆内的皮质激素显著上升［5］. 我们的实验也表明，急性的噪声应激会导致大鼠血浆内的皮质醇水平较正常状态下大鼠显著升高，并且随应激时间的延长升高更加明显.

　　褪黑素(MT)是松果腺分泌的一种吲哚类的化学物质,对应激反应有着重要影响. MT的合成分泌与日照周期同步,呈现极显著的昼低夜高的生理性节律波动［6］，并且与HPA轴所涉及的激素分泌节律恰恰相反，这提示两者可能有着一定的关系. 研究表明，腹腔注射0.2 mg/kg剂量的MT即可改善外源性皮质醇所诱导的大鼠血浆ACTH及皮质酮水平下降［7］. 为避免内源性MT对实验结果的影响，本实验在早8时开始. 实验显示，两实验组的血浆皮质醇水平均显著低于相应模型组，尽管略高于空白对照组，但已无显著差异. 这说明外源性的MT可以使大鼠血浆内的皮质激素水平接近于正常水平，提示可能机体应激状态有所改善.

　　A: 空白对照组HE ×100; B: 模型1组HE ×400; C: 实验1组HE ×400; D: 模型2组HE ×400; E: 实验2组HE ×400.

　　图1各组大鼠肝脏组织形态（略）

　　超氧化物歧化酶(SOD)是一类广泛存在于生物体内含不同金属元素的酶蛋白,是唯一能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的生物酶, 使超氧自由基分解,快速清除体内过剩的氧自由基. 机体在处于应激状态时，体内的氧自由基含量可以明显高于正常状态. 而丙二醛（MDA）是机体氧自由基与生物膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物,其产生的量与氧自由基的量及脂质过氧化的程度呈正相关,故检测MDA 可反映氧自由基的水平及脂质过氧化的程度. 本实验发现，实验组大鼠血清及肝脏中SOD活性和MDA含量较空白对照组均有明显升高，说明噪声可以损伤到肝脏组织的正常功能.

　　实验结果显示，噪声可使大鼠处于明显的应激状态，兴奋HPA轴，提高血浆内皮质醇水平，并且随应激的加强皮质醇水平升高更加明显. 在HPA轴的影响下，大鼠血清及肝匀浆的SOD活性和MDA含量产生异常变化，同时肝脏功能受到损害. 而外源性的MT抑制了应激所导致的HPA轴的兴奋，使血清中SOD活性和MDA含量接近于正常水平，拮抗了应激所致的肝脏功能紊乱. 病理检查结果也显示，实验组的肝组织较模型组损伤明显减轻. 我们既往的研究也发现，MT对酒精所诱导的肝损伤具有保护作用［8］. 由于MT在人体内尚未发现毒性作用，在多种动物体内也未建立其半数致死剂量(LD50)，故其临床应用具有较高的安全性. 进一步开展MT的临床研究，可望使其成为应激性肝脏功能紊乱措施的一种新选择.

【】
  　　［1］ 孙喜庆，刘挺松，曹新生，等. +6 Gz和噪声复合应激对大鼠学习记忆的影响［J］. 第四军医大学学报,2004,25(21):1928-1931.

　　［2］ 王亚东，杨海燕. 噪声接触与神经行为功能关系的Meta分析［J］. 实用预防医学，2005,12:284-285.

　　［3］ 穆振斌，黄裕新，赵保民，等. 枪击噪音对大鼠胃肠传输液体食物的影响及其机制探讨 ［J］. 解放军医学杂志, 2004,29(11):991-992.

　　［4］ Seematfer G， Binnert C， Martin JL， et al. Relationship between stress inflammation and metabolism［J］. Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2004，7(2)：169-173.

　　［5］ 尹剑春，童昭岗，颜军. 中小负荷运动对反复心理应激大鼠血清皮质酮、IL?2和血浆T淋巴细胞亚群的影响［J］. 运动医学杂志，2005，24（4）：419-423.

　　［6］ Ana I, Esquifino SR. Pandi?Perumal, Daniel P. Cardinali．Circadian organization of the immune response: A role for melatonin［J］. Clin Appl Immunol Rev, 2004，4 ：423-433.

　　［7］ 钟历勇，沈自尹，冉瑞琼，等. 褪黑素对大鼠下丘脑?垂体?肾上腺轴及免疫功能受抑状态的影响［J］. 中国免疫学杂志，2003，19(11)：761-764.

　　［8］ 刘卫辉，蔡川，周扬，等. 褪黑素对乙醇致小鼠慢性肝损伤的保护作用［J］. 第四军医大学学报，2006，27（18）：1665-1667.