Survivin shRNA真核表达载体的构建及其生物学作用
【摘要】 目的： 构建存活素（survivin）基因短发夹RNA(shRNA)的表达质粒，为乳腺癌RNAi介导的基因打下基础. 方法： 设计并合成有小发夹结构的8条survivin shRNA对应模板序列，退火并与pShuttle 1.0?CMV载体重组质粒；将重组质粒转染人乳腺癌细胞MCF?7；MTT实验筛选出最有效质粒及其有效浓度，流式细胞术检测细胞周期的变化，经Hoechst染色观察凋亡情况，RT?PCR和Western Blot检测survivin基因的表达情况. 结果： 成功构建重组质粒并筛选出最有效质粒及其有效浓度；细胞受阻于G2/M期，并通过荧光染色发现有凋亡细胞；survivin基因表达受到抑制. 结论： 构建的重组质粒能抑制survivin基因的表达，这为研究乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.
【关键词】 survivin； RNA干扰； shRNA
0引言
存活素（survivin）基因几乎表达于所有常见的人类肿瘤组织，尤见于乳腺癌和肺癌［1］. 有研究证明将小于30个核苷酸的小干扰RNA（small interferencing RNA, siRNA）或短发夹RNA(shRNA)表达载体转入哺乳动物细胞中，同样能产生沉默效应. 目前，其载体构建大多是用RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子U6或H1进行表达的［2-3］，但是用RNA polⅡ依赖的巨细胞病毒立即早期启动子同样有效［4］. 本实验我们设计针对survivin基因的shRNA表达质粒，将其转染人乳腺癌MCF?7细胞，初步探讨其诱导MCF?7细胞凋亡情况及对survivin基因表达的影响.
1材料和方法
1.1材料pShuttle 1.0?CMV载体（产地ambion公司）；Lipofectamine 2000转染试剂盒(invitrogen)；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶（大连宝生物公司）；总RNA提取试剂盒(加拿大BioBasic公司)；逆转录聚合酶链反应( RT?PCR)试剂盒（美国Qiagen公司）.
1.2方法
1.2.1shRNA的设计根据survivin基因的序列在线设计3个可干扰序列： ① 5′?GGACCACCGC ATCTCTACATTCAAGAAC?3′, ②5′?ACAGAGAAAG AGCCAAGAACAAA?3′, ③5′?AATTTGA GGAAACTGCGGAGA?3′和一个错义序列5′?TATGAGAATGGCAGCGA GATA?3′（其碱基组成同序列③，但排列顺序不同），同源分析未见相同序列.
1.2.2重组质粒的构建和鉴定shRNA转录模板DNA链的设计： 按pShuttle 1.0?CMV载体要求以反向重复方式设计发夹结构：正义链：5′?CTAGT反向序列TCTCTTGAA正向序列C?3′，反义链：5′?TCGAG正向序列TTCAAGAGA反向序列A?3′. 重组质粒的构建：模板链合成并退火，将其定向克隆至穿梭载体pShuttle 1.0?CMV中；转化DH5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选单克隆，分别命名为pShuttle?survivin(1?3)和pShuttle?control. 重组质粒的鉴定：提取质粒分别用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，取初步鉴定的质粒送上海生物工程技术服务有限公司测序.
1.2.3细胞培养与转染乳腺癌细胞株MCF?7用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液培养于37℃含50 mL/L CO2的培养箱中. 转染前24 h将约1×105个细胞接种至6孔板，转染时细胞融合度达30%～50%. 按Lipofectamine 2000操作手册进行转染：用质粒pShuttle?survivin(1?3)以50 nmol/L的浓度分别转染细胞，设立阴性（加pShuttle?control）和空白对照组（加Lipofectamine 2000），每组设3个平行孔，培养24 h后行MTT检测，筛选出最有效的shRNA表达质粒，将最有效的质粒分别以5，10，50，100，150 nmol/L的终浓度转染MCF?7细胞，每组设3个平行孔，设立对照组，培养24 h后再次行MTT检测［5］.
1.2.4流式细胞术检测接种MCF?7细胞于60 mm平皿中（2×106/皿）. 接种后24 h，以最有效质粒的最佳浓度转染细胞，设阴性和空白对照组. 转染后48 h收集细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗1次，离心去PBS，加入预冷的700 mL/L的乙醇，4℃固定16 h以上. 离心去乙醇，PBS清洗1次，加0.5 mL 50 mg/L PI（含100 mg/L RNase A）于避光处染色30 min，用Coulter EPTCSXL?31240流式细胞仪进行检测.
1.2.5Hoechst荧光染色检测凋亡取普通洁净盖玻片于750 mL/L乙醇中浸泡24 h以上，风干，将盖玻片置于六孔板内，种入MCF?7细胞培养过夜. 加入含最有效质粒的最佳浓度的培养基，作用24 h，设阴性和空白对照组. 吸尽培养液，加入0.5 mL固定液，4℃固定过夜. 去固定液，用PBS洗两遍，每次3 min，吸尽液体. 加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，摇床上染色5 min. 用PBS洗两遍，每次3 min. 加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜检测.
1.2.6RT?PCR检测按一步法RT?PCR试剂盒说明书提取RNA后行PCR. survivin基因引物（产物为166 bp）P1：5′?cagatttgaatcgcgggaccc?3′，P2：5′?ccaagtctggctcgt tctcag?3′；GAPDH 引物（产物为280 bp）P1：5′?gtagaggcag ggatgatgttc?3′，P2：5′?gagttag ctcactcattaggc?3′. 反应条件：50℃反转录30 min；95℃初始PCR激活反应15 min；94℃变性0.5 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min；共35个循环；72℃反应延伸10 min. 取PCR产物3 μL于10 g/L琼脂糖凝胶电泳.
1.2.7Western Blot检测细胞转染后48 h提取总蛋白，经Bradford法测定蛋白浓度，设立空白和阴性对照. 每组分别取20 μg用以检测内参β?actin蛋白质，取60 μg以检测Survivin蛋白，蛋白经100 g/L SDS?PAGE电泳，100 V电转1 h，100 g/L脱脂奶封闭过夜. 在装有抗Survivin抗体和PVDF膜的袋中室温下摇动2 h，洗膜后加入二抗，室温下摇动1 h. 增强化学发光显色曝光.
统计学处理：采用SAS8.0软件包进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1重组质粒酶切鉴定及测序结果该试剂盒提供的穿梭载体中不存在EcoRⅠ位点，但存在XhoⅠ位点，故用这两种酶分别消化后其分子大小虽相同，但由于分子形状不同而电泳速度不同（图1）. 测序结果证实构建成功.
1,2; 3,4; 5,6: 重组质粒pShuttle?survivin(1?3); 7,8: pShuttle?control; 1,3,5,7: XhoⅠ酶切； 2,4,6,8: EcoRⅠ酶切.
图1重组质粒的EcoRⅠ或XhoⅠ酶切结果（略）
2.2MTT法筛选结果转染pShuttle?survivin(1?3)，Lipofectamine 2000和pShuttle?control各组干扰效率与空白对照组相比较，分别为：65.53%，76.12%，86.68%，4.40%和7.70%. 对MTT检测结果进行完全随机设计的方差分析： Lipofectamin 2000组，pShuttle?control组与空白对照组间的差异无统计学意义(P>0.05),表明Lipofectamine 2000和错义序列不会影响MCF?7细胞的生长；而pShuttle?survivin(1?3)组与空白对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)，以pShuttle?survivin3的干扰效果最佳. 在转染了不同浓度pShuttle?survivin3后24 h，5，10，50，100，150 nmol/L组干扰效率分别为80.41%，93.35%，84.52%，72.07%和68.33%，经q检验法分析，各组两两间的差异均有统计学意义(P<0.05).
2.3流式细胞术结果流式细胞术检测显示转染组中G2/M期细胞的比率升高. 错义序列组和脂质体对照组中，MCF?7细胞的细胞周期未出现上述变化(图2)，表明shRNA表达载体的转染对MCF?7细胞的增殖具有抑制作用，与MTT比色法检测的结果相符.
A: Shuttle?Control组； B: Lipofectamine 2000组； C: pShuttle?survivin3组.
图2流式细胞术结果（略）
2.4Hoechst荧光染色结果Hoechst33258染色检测显示实验组的细胞核出现凋亡的形态学改变(图3)，表现为细胞核染色质高度聚集并裂解为碎块，可见凋亡小体；脂质体对照组及错义序列对照组的细胞，均没有出现上述形态学改变.
A: pShuttle?Control组； B: Lipofectamine 2000组； C: pShuttle?survivin3组.
图3转染shRNA后MCF?7细胞的形态学改变Hoechst染色 ×400（略）
2.5RT?PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳显示，脂质体空白对照组及错义序列组的样本于约166 bp处均可见清晰的条带，实验组的条带明显减弱，而各组相应的内参照GAPDH的条带一致(图4).
2.6Western Blot检测PBS及pShuttle?control组均可见清晰的条带，而pShuttle?survivin组的条带明显减弱；各组相应的内参照的条带一致(图5).
3讨论
在细胞增殖周期中，survivin基因主要表达于G2/M期，起调节基因作用，可对抗G2/M期凋亡的诱导，在癌症中的过度表达克服凋亡的关卡（checkpoint），抑制胞凋亡效应性蛋白酶Caspase3，通过有丝分裂促进转化细胞的异常增殖（aberrant progression）［6］；同时引起细胞c?Myc和cyclinD1的表达水平增高，激活端粒酶，从而延长细胞的寿命，导致细胞癌变，在肿瘤的发生中起重要作用.
1: pShuttle?Control组; 2: pShuttle?survivin3组; 3: Lipofectamine 2000组； M： marker.
图4RT?PCR结果（略）
1: PBS空白对照组； 2: pShuttle?survivin3组； 3: pShuttle?Control组.
图5Western Blot检测结果（略）
自从RNAi现象发现至今，研究人员一直试图解释它的机制. 有研究报道在拟南芥转录后沉默中有与沉默基因两条链都互补的（21～23）个核苷酸的小RNA分子［7］. 随后这些小分子RNA进行了测序分析，发现它们是3′末端带有2个核苷酸突出的（21～23）个核苷酸的dsRNA分子. 后来将这些RNA分子命名为短干扰性RNA. 大于30个核苷酸的dsRNA被导入哺乳动物细胞中，会激活抗病毒反应引起非特异性干扰素效应［8］，所以在这类细胞中需要另寻途径获得稳定的基于dsRNA的沉默效应［9］，很多靶序列不具备这些特点同样有效，甚至有些基因靠近3′的靶点反而更有效［10］.
本实验基于上述shRNA设计的一般原则，结合载体系统要求再线设计了3种shRNA并克隆到穿梭载体中，为了达到而有效的干扰效果并减少对细胞的毒性，在转染MCF?7细胞后，通过MTT实验筛选出最有效质粒及其有效浓度. 流式细胞术检测虽未有凋亡峰出现，但处于G2/M期的细胞明显增多，并进一步通过Hoechst染色观察到典型的凋亡现象；RT?PCR和Western Blot发现survivin基因的表达明显受到抑制. 该表达载体的构建与筛选，为下一步用腺病毒包装，感染荷瘤裸鼠行靶向RNAi抗乳腺癌的体内研究打下坚实的基础.
【】
［1］ Tamm I, Wang Y, Sausville E, et al. IAP?family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs［J］. Cancer Res,1998,58(23):5315-5320.
［2］ 刘军,郭颖,薛采芳,等. 哺乳动物细胞siRNA表达载体的构建及鉴定［J］. 第四军医大学学报,2003,27(3):230-233.
［3］ 石丛艳,郭德玉. Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序［J］. 第四军医大学学报,2006,24(24):2235-2237.
［4］ Zeng Y, Wagner EJ, Cullen BR, et al. Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells ［J］. Mol Cell, 2002,9 (6):1327-1333.
［5］ 谷敏,陈子兴,岑建农,等. RNA干扰对乳腺癌MCF?7细胞株WT1基因表达的抑制作用［J］. 肿瘤,2007,27(1):16-21.
［6］ Andrade F, Roy S, Nicholson D, et al. Granzyme B directly and efficiently cleaves several downstream caspase substrates: implications for CTL?induced apoptosis［J］. Immunity, 1998,8(4):4512-4560.
［7］ Hamilton AJ, Barlcome DC. A species of small antisenes RNA in posttranscriptional gene silencing in plants［J］. Science,1999,286(9):950-952.
［8］ Gil J, Esteban M. Induction of apoptosis by the dsRNA?dependent protein kinase(PKR): Mechanism of action［J］. Apoptosis, 2000,5(2):107-114.
［9］ Tuschl T. Expanding small RNA interference ［J］. Nat Biotechnol, 2002,20(5):446-448.
［10］ McManus MT, Haines BB, Dillon CP, et al. Small interfering RNA?mediated gene silencing in T lymphocytes ［J］. J Immunol, 2002,169(10):5754-5760.
