单核苷酸多态性芯片分析胰腺癌基因组杂合性缺失

              作者：林连捷，林艳，郑长青，刘香，金玉

【摘要】  目的：研究细胞基因组范围内的杂合性缺失（LOH），比较白种人和日本人的异同. 方法：应用高密度单核苷酸多态性(SNP)芯片，检测14种白种人和7种日本人胰腺癌细胞株基因组范围内的LOH. 结果:每一种胰腺癌细胞基因组中都有不同程度的LOH，染色体臂9p的LOH频率最高（19/21，90.5%）；白种人和日本人胰腺癌细胞株不同染色体臂出现LOH频率不同，白种人中最常见的LOH是9p（14/14，100.0%），17p（13/14，92.9%），18q（13/14，92.9%）等，而日本人出现频率最高的是13q (6/7, 85.7%). 白种人和日本人共同的高频率的（50%以上）LOH出现在染色体臂3p，8p，9p，13q，17p和18q. 结论:胰腺癌出现多处LOH; 不同种族LOH出现可能频率不同.

【关键词】  单核苷酸多态性芯片;杂合性缺失;胰腺肿瘤

     0引言

    杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）是一种在肿瘤细胞中常见的DNA异常， LOH区域常含有抑癌基因，与肿瘤的发生有密切关系［1］. 因此分析LOH为定位和发现抑癌基因的有效手段. 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)芯片在检测DNA拷贝数目异常的同时，根据杂合性信号的有无可以检测LOH的存在与否. 我们应用Affymetrix公司推出的高密度SNP芯片，研究来自白种人和日本人的21种胰腺癌细胞株基因组范围的LOH.

    1材料和方法

    1.1材料人类胰腺癌细胞株21种分别来源于白种人（14种）或日本人（7种）. 其中白种人胰腺癌细胞AsPC?1, BxPC?3, Capan?1, Capan?2, CFPAC?1, HPAF?II, Hs 700T, Hs 766T, Panc 02.03, Panc 03.27, Panc 05.04, Panc 08.13和SW 1990来自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)；MIA PaCa?2来自日本细胞库Japanese Collection of Research Bioresources （JCRB, Osaka, Japan）. 日本人胰腺癌细胞株KP?1N， KP?2， KP?3和KP?4来自日本组织培养学会细胞库，KLM?1和NOR?P1来自日本东北大学加龄医学研究所，T3M?4来自日本理化学研究所. 各种细胞株在推荐的培养液中培养，培养液购自Sigma公司.

    1.2方法应用试剂盒Puregene DNA Isolation Kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN). 根据说明书提取细胞基因组DNA，分光光度计测其浓度和纯度. Affymetrix基因芯片系统包括全自动芯片洗涤工作站，高分辨率芯片扫描仪和杂交箱. 根据操作手册，从细胞株中提取DNA后，250 ng DNA用2种限制性内切酶XbaI或HindIII消化，末端连接Adapter后进行PCR. PCR产物片断化后,末端进行标志, 然后与Affymetrix公司的GeneChip? Human Mapping 100K Mapping microarray上的探针杂交. 检测基因芯片上的近100 000个SNP荧光信号，应用分析软件名为Copy Number Analyzer for the Affymetrix GeneChip Mapping 100K array (CNAG)，通过分析杂合性信号的有无判断LOH的存在与否.

    2结果

    2.1胰腺癌细胞株的基因组LOH概况在21种胰腺癌细胞基因组中，每一种细胞都有不同程度的LOH(表略). 其中T3M?4细胞的24条染色体臂发生LOH频率最高（54.5%）. NOR?P1出现频率最低，只有3条染色体臂发生LOH（6.8%）. 高频率（>50%）LOH出现在染色体臂9p（19/21，90.5%），17p（18/21，85.7%）， 18q（18/21，85.7%），6q（14/21，66.7%），13q（14/21，66.7%），8p（13/21，61.9%），12q（13/21，61.9%），3p（12/21，57.1%），6p（12/21，57.1%），9q（11/21，52.3%）.

    2.2白种人和日本人胰腺癌细胞株中LOH比较白种人和日本人胰腺癌细胞株不同染色体臂出现LOH频率不同，图1显示了22对染色体臂LOH在白种人和日本人胰腺癌细胞株基因组出现频率. 白种人的胰腺癌细胞株中高频率的（>50%）LOH出现在染色体臂9p（14/14，100.0%），17p（13/14，92.9%），18q（13/14，92.9%），12q（10/14，71.4%）, 6q（9/14，64.3%），8p（9/14，64.3%）， 3p（8/14，57.1%），9q（8/14，57.1%）和13q（8/14，57.1%）. 日本人细胞株中高频率的LOH出现在染色体臂13q(6/7, 85.7%),4q(5/7, 71.4%)，6p(5/7, 71.4%)，6q(5/7, 71.4%),9p(5/7, 71.4%)，10p(5/7, 71.4%)，17p(5/7, 71.4%)，18q(5/7, 71.4%)，3p(4/7, 57.1%)，4p(4/7, 57.1%)，8p(4/7, 57.1%)，10q(4/7, 57.1%)，18p(4/7, 57.1%)，19p(4/7, 57.1%)，19q(4/7, 57.1%)和22q(4/7, 57.1%). 白种人和日本人共同的高频率的LOH出现在染色体臂3p，6q，8p，9p，13q，17p和18q.

    3讨论

    SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性. 它在人类基因组中广泛

    图1白种人和日本人胰腺癌22对染色体臂LOH发生频率比较

    存在，平均每500~1000个碱基对中就有1个，是继限制性片段长度多态性和微卫星标记之后的第三代遗传标记. 由于SNP遍布于整个人类基因组中及其二态性自身的特性决定了它适合于快速、规模化筛查. Calhourn等［2］发现与微卫星标记法相比较，应用SNP芯片可以提高120倍杂合性信号，有利于LOH的研究. SNP芯片引起了学者关注，应用于膀胱癌、卵巢癌、肺癌及前列腺癌等肿瘤全基因组范围的DNA数目或LOH的研究［3-6］. 我们应用的CNAG软件优化了对照组的选择，不需要从同一患者取正常组织作为对照，这使研究细胞株基因组变化成为可能［7］. 应用Affymetrix公司推出的GeneChip Human Mapping 100K Array，芯片涵盖了从TSC （The SNP Consortium）数据库挑选出的116 204个单核苷酸多态性SNP位点，SNP位点间的中位物理距离接近8.5 kb,平均间距是23.6 kb，解析度高，这些SNPs的平均杂合性是0.30,通过分析杂合性信号的有无可以判断LOH的存在与否，提供一个全基因组的“扫描图”，直观地表示出21种胰腺癌细胞株LOH. 细胞株可以在实验室之间分享，研究具有较高的可重复性，克服了临床同源标本来源的限制，研究细胞株是肿瘤研究的常用方法. 但是细胞株缺乏正常对照，所以传统的研究方法难以研究细胞株的LOH. LOH是胰腺癌的普遍现象，每种细胞都有不同程度的LOH. 在白种人和日本人中的LOH分布频率不尽相同，白种人中最常见的LOH是9p（14/14，100.0%），17p（13/14，92.9%），18q（13/14，92.9%）等，而日本人出现频率最高的是13q(6/7, 85.7%).

    致谢衷心感谢笹川平和财团和日中医学协会在科研资金方面的资助，感谢东京大学消化内科实验室小俣政男教授等在技术和资金方面的支持.

【】
  ［1］ Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancers［J］. Nature, 1998, 396(6712):643-649.

［2］ Calhoun ES, Hucl T, Gallmeier E, et al. Identifying allelic loss and homozygous deletions in pancreatic cancer without matched normals using high?density single?nucleotide polymorphism arrays［J］. Cancer Res, 2006, 66(16):7920-7928.

［3］ Koed K, Wiuf C, Christensen LL, et al. High?density single nucleotide polymorphism array defines novel stage and location?dependent allelic imbalances in human bladder tumors［J］. Cancer Res, 2005, 65(1):34-45.

［4］ Thompson ER, Herbert SC, Forrest SM, et al. Whole genome SNP arrays using DNA derived from formalin?fixed, paraffin?embedded ovarian tumor tissue［J］. Hum Mutat, 2005, 26(4):384-389.

［5］ Liu W, Chang B, Sauvageot J, et al. Comprehensive assessment of DNA copy number alterations in human prostate cancers using Affymetrix 100K SNP mapping array［J］. Genes Chromosomes Cancer, 2006, 45(11):1018-1032.

［6］ Torring N, Borre M, Sorensen KD, et al. Genome?wide analysis of allelic imbalance in prostate cancer using the Affymetrix 50K SNP mapping array ［J］. Br J Cancer, 2007, 96(3):499-506.

［7］ Nannya Y, Sanada M, Nakazaki K, et al. A robust algorithm for copy number detection using high?density oligonucleotide single nucleotide polymorphism genotyping arrays［J］. Cancer Res, 2005, 65(14):6071-6079.