血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建

           作者：孟国林，段春光，刘建，吕昌伟，杨旻，袁志，胡蕴玉 

【摘要】  目的：构建并制备血管生成素?1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体. 方法：采用基因克隆技术克隆目的基因ANG?1，并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrack?CMV；使用Padeasy?1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌BJ5183中同源重组，产生重组腺病毒载体；线性化重组的腺病毒转染入QBI?293A细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增. 结果：ANG?1基因与腺病毒穿梭载体连接成功，经Xho I/EcoR V双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5 kb处出现特异性条带，证明pAdTrack?CMV?ANG?1重组质粒构建成功；重组的穿梭载体与pAdeasy?1质粒重组后，产物经Pac I酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段. 大小约为30 kb和4.5 kb，与预期结果相符，证明重组腺病毒pAd?ANG?1?EGFP构建成功；线性化重组的腺病毒转染入QBI?293A细胞后包装成功. 扩增后病毒滴度为2×1014 v.g./L，EGFP活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上. 结论：成功制备了pAd?ANG?1?EGFP腺病毒. 为骨组织工程血管化的研究打下基础.

【关键词】  血管生成素； 腺病毒； 基因转染； 增强型绿色荧光蛋白

    0引言

    大段骨缺损的修复一直是临床上难以解决的难题，而缺乏足够的血运是其难以修复的重要原因. 因此血管化的研究在大段骨缺损的研究中显得极为重要. 血管的形成可分为血管发生和血管生成，成熟个体形成血管的唯一方式是血管生成，而ANG?1在这一过程中起着重要的调节作用［1-2］. 所以对于ANG?1的研究对于大段骨缺损的显得极有意义. 本研究中， 我们设计、 构建了携带ANG?1基因的腺病毒（adenovirus）， 为探索大段骨缺损的血管化打下了基础.

    1材料和方法

    1.1材料pcDNA3.1(+)真核表达载体由本室保存，质粒pAdTrack?CMV(含EGFP基因)、pAdeasy?1, 菌种BJ5183购自Stratagene公司；293A细胞株、转染试剂(lipofectamine 2000)购自Invitrogen公司. 各种限制性内切酶，T4连接酶、反转录酶PrimeScriptTM Reverse Transcriptase, DNA聚合酶（PrimeSTARTM HS DNA polymerase）, PMD18?T vector购自Takara公司. 质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自（OMEGA BIO?TEK）公司,mRNA提取试剂（PolyAtract system 1000）,M?MLV购自Promega公司.

    1.2方法

    1.2.1血管生成素?1 （ANG?1）基因的克隆及鉴定①在Genebank上查询ANG?1的序列为NM_001146. 根据此序列设计引物. 引物序列为：F: CCGCTCGAG ATGACAGTTTTCCTTTCC,  R: TTTGATATCTCAAAAATCTAAAGGTCG上游引物引入XhoⅠ位点，下游引物引入EcoRⅤ位点. ②RNA的提取及cDNA的获得：使用PolyAtract system 1000试剂盒从胎盘组织中提取mRNA提取步骤按照说明书进行，将提取的mRNA使用反转录酶PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反转录为cDNA，步骤按照说明书进行. ③PCR扩增ANG?1 基因片段：以上述获得的cDNA为模板，进行PCR反应. 反应条件为98℃ 10 s, 65℃ 5 s, 72℃ 2.5 min. 35个循环. 琼脂糖电泳鉴定. ④ANG?1克隆入PMD18?T vector，DNA测序鉴定：将PCR产物进行凝胶回收纯化后，克隆至PMD18?T vector中，将质粒PMD18?T?ANG?1转化至细菌DH5α中，扩增后送公司测序.

    1.2.2携带ANG?1基因和报告基因EGFP 的腺病毒载体的构建①将基因ANG?1克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack?CMV：质粒PMD18?T?ANG?1和穿梭载体pAdTrack?CMV（含有基因EGFP）分别进行XhoⅠ/EcoRⅤ双酶切，产物胶回收后，按15∶1比例混合，加入T4连接酶进行连接. 转化入细菌DH5α，提取克隆进行酶切鉴定. ②病毒的重组：先将腺病毒骨架质粒pAdeasy?1转化入细菌BJ5183中，得到含有pAdeasy?1的BJ5183细菌，将鉴定正确的携带目的基因ANG?1的穿梭载体转化入含有pAdeasy?1的 BJ5183中进行同源重组. 挑取其中较小的菌落扩增、提取质粒. ③重组病毒的鉴定：将重组的质粒Pac I酶切后进行8 g/L琼脂糖电泳，与标准的重组腺病毒酶切谱形进行对比，鉴定得到的重组病毒是否正确.

    1.2.3重组腺病毒的包装及扩增①腺病毒的包装：培养293A细胞，6孔板按每孔4×105铺细胞，第2 d将重组的腺病毒质粒Pac I酶切线性化，并胶回收法纯化. 然后将线性化的质粒DNA使用脂质体lipofectamine 2000转染入293A细胞中. 第4 d换液，第11 d收集细胞，反复冻融收集病毒. ②腺病毒的扩增：得到病毒的1/3用于感染新的293A细胞，48 h收集细胞. 如此反复共进行4轮扩增，收集所有细胞，反复冻融，得到重组腺病毒.

    1.2.4重组病毒物理滴度测定采用点杂交法测定重组病毒的物理滴度（以载体基因组数量/L表示，即v.g./L）具体方法如［5］.

    1.2.5重组病毒EGFP的活性检测培养293A细胞，按5×104/孔细胞接种于24孔细胞培养板中，常规培养24 h. 按MOI梯度值（2×105, 1×105, 5×104）确定重组病毒加样量. 阳性对照病毒由本元正阳基因基因技术有限公司提供(物理滴度为1×1015 v.g./L),加样MOI值为1×105.

    2结果

    2.1ANG?1基因的克隆及鉴定经过提取mRNA、反转录、PCR扩增得到了大小约为1.5 kb的预期片段. 经酶切鉴定，及DNA测序分析证实ANG?1基因克隆成功.

    2.2腺病毒载体的构建及鉴定基因ANG?1成功克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack?CMV中，穿梭载体pAd Track?CMV?ANG?1与骨架DNA在细菌BJ5183中成功重组出腺病毒pAd?ANG?1?EGFP. 重组的腺病毒质粒经Pac I酶切，8 g/L琼脂糖电泳分析. 在图2中可见经Pac I酶切后出现一大一小2个片段，大片段约为30 kb，小片段约为4.5 kb. 与预期的谱形相同. 证实重组腺病毒成功.

    2.3重组腺病毒的包装及扩增重组的腺病毒DNA经线性化后转染入293A细胞，在293A细胞中包装腺病毒. 在包装的第3，5，8，11 d分别用倒置荧光显微镜观察，发现荧光逐渐增多，光镜下观察细胞在8 d出现病理性变化（CPE）. 证实病毒包装成功. 将得到的病毒继续感染新的293A细胞，扩增病毒. 经过4轮扩增，最终病毒的滴度达到2×1014 v.g./L.

    2.4重组腺病毒的EGFP活性检测重组腺病毒各MOI梯度的EGFP活性不一（表1，图3）.表1重组病毒EGFP的活性检测结果

    3讨论

    目前在血管化的研究中，促血管形成的细胞因子的研究正在成为热点. 相对于直接应用蛋白分子，基因治疗有着价格低廉，作用持久的优势. 本研究设计使用重组腺病毒作为基因治疗的手段. 相对于其他方式，重组腺病毒有着其本身独有的优势：毒感染效率高，可达到90%以上；不整合如宿主细胞的DNA，安全性较好；携带基因表达的时间约4~8 wk，这与骨愈合的时间相符，因此是骨组织工程研究的理想的工具［6］.

    ANG?1基因在1996年由Davis首次克隆出来，具有抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞出芽、迁移和趋化等重要作用，在成骨细胞有明显表达，在骨折愈合过程中发挥重要作用.  我们克隆了基因ANG?1,并使用经典的pAdeasy?1系统［7］构建并包装扩增带有ANG?1和EGFP的腺病毒. 在腺病毒的重组中，我们较之经典方法做了一些改进. 在经典的方法中，穿梭载体和骨架质粒是使用磷酸钙法同时转入细菌BJ5183中进行同源重组的，而我们在本研究中采用分步转化的方法先将骨架基因转化入BJ5183中，然后再将携带目的基因的穿梭载体pAdTrack?CMV?ANG?1转化入含有病毒骨架基因的BJ5183中，完成同源重组. 经过改进后的方法同源重组正确的几率大大提高. 在我们的实际工作中，该方法重组后挑选最小的10个克隆，经Pac I酶切鉴定，有8个正确. 同源重组的正确率在80%. 重组后的病毒DNA经293A细胞包装并扩增后滴度可达到2×1014 v.g./L.

    病毒感染效率实验显示本研究制备的腺病毒有着较高的感染效率, 可用于血管化的相关实验研究.

【参考文献】
  ［1］ Hildbmnd P, Cinilli V, Prinsen EC, et al. The role of angiopoietins in the development of endothelial cells from cord blood CD34+ progenitors［J］. Blood,2004,104(7):2010-2019.

［2］ Young MR. Tumor skewing of CD34+ progenitor cell differentiation into endothelial cells［J］. Int J Cancer,2004,109(4):516-524.

［3］ Gluzman Z, Koren B, Preis M, et al. Endothelial cells are activated by angiopoeitin?1 gene transfer and produce coordinated sprouting in vitro and arteriogenesis in vivo［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2007,359(2):263-268.

［4］ Plaisier M, Rodrigues S, Willems F, et al. Different degrees of vascularization and their relationship to the expression of vascular endothelial growth factor, placental growth factor, angiopoietins, and their receptors in first?trimester decidual tissues［J］. Fertil Steril, 2007, 88(1):176-187.

［5］ 王卫东，陈长生，蒋立新,等. 携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备［J］. 第四军医大学学报，2007，28（22）：2025-2028.

［6］ Onda T, Honmou O, Harada K, et al. Therapeutic benefits by human mesenchymal stem cells (hMSCs) and Ang?1 gene?modified hMSCs after cerebral ischemia［J］. J Cereb Blood Flow Metab, 2008, 28(2):329-340.

［7］ Tong?Chuan HE, Zhou SB, Luis T, et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses［J］. Porc Natl Acad Sci, 1998, 95:2509-2514.