不同维生素A营养状态下血清视黄醇水平与机体抗氧化能力的相关分析

           作者：黄鸿眉, 魏华, 江伟, 张萱, 陈科, 谭旭, 瞿平, 刘友学, 杨莉, 李廷玉 

【摘要】  目的： 通过检测不同维生素A(VA) 状态对大鼠血清视黄醇水平与抗氧化能力的影响，分析两者之间的相关性，探讨体内重要的VA代谢中间产物视黄醇与机体脂质过氧化及抗氧化系统之间的关系. 方法： 9只健康雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组、VA缺乏组(VAD)和VA补充组(VAS)，从交配前3 wk开始分别饲予VA缺乏饲料（含视黄醇 400 U/kg）和正常饲料（含视黄醇6500 U/kg）. 正常对照组和VAD组仔鼠断乳后，继续饲予与其母鼠相同的饲料至生后8 wk；VAS组仔鼠在出生0 d开始补充. 高效液相技术检测血清视黄醇浓度，试剂盒检测血清抗氧化酶及产物超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH?Px)及脂质过氧化物和丙二醛(MDA)水平. 结果： VAD组仔鼠血清视黄醇浓度低于正常对照组和VAS组(P<0.05)，VAS组血清视黄醇浓度与正常对照组无差异(P<0.05). 与正常对照组相比，VAD组仔鼠血清抗氧化酶SOD和GSH?Px水平降低，而MDA水平升高，VAS组可观察到抗氧化酶SOD, GSH?Px和脂质过氧化物MDA水平恢复到正常对照组水平. 血清中视黄醇水平与抗氧化酶SOD活性呈正相关（r=0.4574）; 血清中视黄醇水平与脂质过氧化产物MDA呈负相关（r=-0.4870）；血清抗氧化酶GSH?Px活性与视黄醇水平无相关. 结论： 血清中视黄醇水平与抗氧化酶SOD活性、脂质过氧化物MDA水平密切相关，提示VA营养状态能够通过调节抗氧化酶活性和脂质过氧化反应而影响机体的抗氧化系统.

【关键词】  血清视黄醇；抗氧化剂；维生素A

　　【Abstract】AIM: To explore the effects of different vitamin A status on the serum retinol level and antioxidant abilities of rats and to discuss the correlation between serum retinol level and antioxidant abilities under different vitamin A status. METHODS:  Nine Female Wistar rats (160-220 g) were used. From 3 weeks before coitus, 3 rats were continually fed the standard diet, which comprised the basic diet supplemented with retinol (6500 U/kg). And other 6 rats received the vitamin A deficient diet, containing the basic diet and retinol(400 U/kg). Pups of the rats receiving the standard diet were fed the standard diet and designated as normal control group. The rats fed vitamin A deficient diet were randomly divided into vitamin A deficient (VAD) group and vitamin A supplement (VAS) group. The rats in VAD group received vitamin A deficient diet after birth and the rats in VAS group were fed the standard diet supplemented with  retinol (50 000 U/kg·d) from birth for 7 days followed by standard diet. Each group comprised 8 pups selected randomly. All rats were executed at week 8 after birth. Serum retinol was collected and retinol level was monitored by HPLC. The total SOD activity, GSH?Px activity and MDA level were measured. RESULTS:  The lower retinol level in serum was observed in the VAD group compared to the control and VAS group at week 8 (P<0.05). But no significant difference in the cerebral cortex and hippocampus retinol level was observed between these 3 groups (P>0.05). The SOD and GSH?Px activity in serum was lower in AVD group than in control group, while the MDA level was higher, which both recovered by the vitamin A supplementation (P<0.05). The serum retinol concentration was positively correlated with the serum SOD activity （r=0.4574）and negatively correlated with the MDA level（r=-0.4870）. No correlation between the GSH?Px activity and retinol level was observed. CONCLUSION:  Serum retinol concentration has significant correlation with SOD activity and MDA level, which suggests that the vitamin A nutrition status can influence the antioxidant system through regulating the antioxidase activities and lipid peroxidation.

　　【Keywords】  serum retinol; antioxidants; vitamin A

　　0引言

　　自由基产生过多与许多疾病的发生密切相关，机体抗氧化系统在免疫、心脑血管疾病、衰老等过程中具有重要的作用［1］. 维生素A （Vitamin A，VA）是人体必需的一种脂溶性维生素，前期研究已经发现VA缺乏能够导致贫血、免疫功能低下、学习记忆功能障碍等疾病［2-3］. VA前体β?胡萝卜素已被证实是重要的抗氧化营养素，但对于VA其他形式的衍生物与脂质过氧化及抗氧化系统之间的关系尚存在不同意见. 我们通过检测大鼠不同维生素A摄入水平对血清视黄醇浓度与抗氧化能力的影响，分析两者之间的相关性，探讨体内重要的VA代谢中间产物视黄醇与机体脂质过氧化及抗氧化系统之间的关系.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　第三军医大学实验动物中心提供清洁级健康雌性Wistar大鼠9只，体质量230～250 g，随机分为3组：(1)正常对照组：母鼠3只，给予VA充足饲料(含视黄醇6500 U／kg)，幼鼠饲料同母鼠；(2)维生素A缺乏组（vitamin A deficient group, VAD组）：母鼠3只，给予VAD饲料(含视黄醇400 U/kg)［2］，幼鼠饲料同母鼠；(3)VA补充组(vitamin A supplementation group, VAS组)：母鼠3只，给予VAD饲料至分娩，出生时连续口服补充适量VA（50 U视黄醇/g·d），补充后1，4，7 d监测血清VA，同时改饲对照组饲料，7 d时可监测到血清VA恢复正常.幼鼠饲对照组饲料. 各组母鼠给予实验饲料3 wk后，与健康雄性Wistar大鼠交配，各组幼鼠随机抽取8只幼鼠，均于8 wk处死进行实验. 母鼠及幼鼠用不锈钢鼠笼饲养，自由进食及饮用蒸馏水，温度19～25℃，湿度55％～65％，每天光照12 h，鼠笼每天清洁消毒1次. 在动物饲养和实验过程中，遵守实验动物管理与动物保护的有关规则. 1∶2雌雄合笼，控制母鼠产仔量为8～14只，不符合条件的幼鼠未纳入实验对象.

　　1．2方法

　　1.2.1血清及脑组织视黄醇水平测定幼鼠断头取血0.5～1.0 mL，静置后，离心3000 r／min，收集200 mL血清，加入无水乙醇、正己烷提取视黄醇，氮气吹干，流动相溶解后，用Waters高效液相色谱仪(746积分仪、501泵、440紫外线检测仪、uBandpakC18柱)检测视黄醇浓度, 制作标准曲线的视黄醇标准品购买自Sigma公司. 检测波长313 nm，流速1.4 mL／min，保留时间3.8 min.

　　1．2.2血清抗氧化水平指标测定测定血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH?Px)及脂质过氧化物和丙二醛(MDA)的水平；所有检测均使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，具体操作步骤见试剂盒说明书.

　　统计学处理：数据均以x±s表示，采用SAS统计学软件进行统计处理，组间比较采用方差分析及LSD?t检验，并进行Square系数相关分析，P＜0.05认为具有统计学意义.

　　2结果

　　2．1不同VA营养状态对血清视黄醇水平的影响VAD组仔鼠8 wk时血清视黄醇水平［(0.54±0.03)μmol/L］ 低于正常对照组［(1.46±0.37) μmol/L］和VAS组［(1.62±0.41)μmol/L, P＜0.01］，VAS组血清视黄醇水平与正常对照组无差异（P＞0.05）.

　　2．2不同VA营养状态对血清抗氧化水平的影响与正常对照组相比，VAD仔鼠血清抗氧化酶SOD和GSH?Px水平降低（P＜0.05），而MDA水平升高（P＜0.05），VAS组可观察到抗氧化酶SOD、GSH?Px和脂质过氧化物MDA水平恢复到正常对照组水平（P＞0.05, 表1）.表1血清抗氧化水平（略）                                  
　
  　2．3血清视黄醇水平与抗氧化能力的相关性分析血清中视黄醇水平与抗氧化酶SOD活性呈正相关（图1A，r=0.4574, P＜0.05）; 血清中视黄醇水平与脂质过氧化产物MDA呈负相关（图1B，r=-0.4870, P＜0.05）；血清抗氧化酶GSH?Px活性与视黄醇水平无相关（图1C，r=0.2767, P＞0.05）.

　　3讨论

　　自由基所导致的机体损伤机制主要是其引起的生物膜脂质过氧化，生产脂质过氧化物，脂质过氧化是指自由基与多不饱和脂肪酸氧化分解成各种产物的复杂过程［4］. VA是一种脂溶性维生素，容易进入细胞膜，而脂质过氧化反应最容易发生在细胞膜上，使细胞膜上的多不饱和脂肪酸产生自由基链式反应［5］. VA的作用主要通过其一系列体内活性代谢产物视黄醇和视黄酸介导，食物来源的VA在肠道转化为视黄醇，在血液循环中与其他转运体结合，如视黄醇结合蛋白（RBP）、甲状腺素运载蛋白(TTR)、载脂蛋白E、载脂蛋白D等［6］. 我们对VA充足、孕期开始的VA缺乏（VAD）和出生时VA补充等三种不同VA营养状态下的大鼠进行了研究，发现血清视黄醇的水平直接受到食物VA供给的影响，VAD组血清视黄醇水平显著低于正常对照组, 补充VA又能够使血清视黄醇浓度恢复正常.

　　VA完全和轻度缺乏均使机体组织脂质过氧化反应增强，并随着VA缺乏的加重而使脂质过氧化程度明显加强［7］. 机体抗氧化酶主要包括GSH?Px，SOD等，GSH?Px是H2O2的最初防御系统，对保护细胞膜结构和功能至关重要，SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，能消除超氧阴离子自由基(O?2)，它可以岐化O?2 为H2O2和O2，终止自由基链锁反应，同时保护GSH?Px免受O?2灭活，其活力反映了机体清除氧自由基的能力. MDA是脂质过氧化链式终止阶段产生的小分子产物，测定MDA的含量可反映自由基产生情况和机体内脂质过氧化的程度，间接反映机体组织和细胞损伤的程度［8］.
　　
    我们发现，与正常对照组相比，VAD仔鼠血清抗氧化酶SOD和GSH?Px水平显著降低，而MDA水平升高，补充VA能够使抗氧化酶SOD，GSH?Px和脂质过氧化物MDA恢复到正常水平. 这些结果提示VA营养状态能够影响脂质过氧化反应和抗氧化酶活性，进而影响机体脂质过氧化和抗氧化系统平衡.

　　本研究发现，在不同VA营养状态下，血清中视黄醇水平与抗氧化酶SOD活性呈正相关, 与脂质过氧化产物MDA水平呈负相关，提示血清视黄醇浓度对机体抗氧化酶和脂质过氧化物水平具有直接影响. 另一个抗氧化酶GSH?Px虽然在VAD组显著降低，随着VA补充又能够恢复，但是与血清中的视黄醇浓度并无直接的相关性，其变化可能接受机体内其他机制的调控. 视黄醇﹑视黄醛﹑视黄酰酯与视黄酸均能在生物体系中抑制脂质过氧化，但它们的抗氧化活性是有差别的，其中视黄醇＞视黄醛＞视黄酰酯＞视黄酸［9］. VA抑制脂质过氧化的作用不是清除引发脂质过氧化的自由基，而是作为阻断反应链的抗氧化剂，与有机过氧自由基结合［1］. 我们的结果显示血清中视黄醇水平与抗氧化酶SOD活性、脂质过氧物MDA水平密切相关，VAD可能通过直接影响SOD的活性和MDA水平，进而影响机体抗氧化系统，调控机体的抗氧化能力，在相关生理病理过程中具有重要的意义. 

【】
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