胶滴肿瘤药敏检测技术（CD?DST）在大肠癌治疗中的应用

                作者：金海敏 李克强 孟庆

【摘要】  从CD?DST的技术原理及特点；在大肠癌的临床和科研中的应用等方面的应用进行综述。认为作为一种先进的体外药敏检测技术，在临床治疗和肿瘤的相关研究中有过成功的报道，但主要在肺癌和妇科肿瘤中多见，大肠癌中的应用还有待拓宽。大肠癌中的应用还有待拓宽。

【关键词】  大脑癌；胶滴肿瘤；药效检测技术

　　Abstract: It makes review on the application of CD?DST on clinical treatment and sci?research of the carcinoma of large intestine from its technological principle and characteristics. It views that as an advanced test technology of medical allergy in vitro, there’s successful report in clinical treatment and concerned scientific study of tumor, however, it’s mainly used in lung cancer and gynecological tumor, the application in the carcinoma of large intestine waits for promotion.

　　Key words: carcinoma of large intestine；CD；DST
   
　　20世纪50年代Back和Speer提出了肿瘤的个体化治疗思想，随后国际上相继建立了一系列药物敏感性试验技术，代表性的有：人体肿瘤克隆形成试验（human tumor cloning assay,HTCA）、四唑蓝比色法(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)、ATP生物荧光体外药敏检测法（ATP?tumor chemosensitivity assay,ATP?TCA）、立体组织培养药物测定试验（histoculture drug response assay,HDRA）。这些方法使得大肠癌的个体化治疗成为可能，并已在临床的实际应用中起到一定的效果。但因为设计方法本身的因素，在应用过程中存在细胞培养困难、所需细胞量大、检测时间长、临床相关性较差等问题，限制其在临床上的进一步应用。在这样的背景下，胶滴肿瘤药敏检测技术（collagen gel droplet culture drug?sensitivity test，CD?DST）的提出和建立，在一定程度上解决了上述方法所存在的问题，具有培养成功率高、所需细胞少、细胞的生物学特性与体内相似、结果可靠性强等优点［1］，是一种先进的体外药敏检测技术。本文现就CD?DST的原理、特点及其在临床大肠癌个体化治疗方面的应用进行简单综述。

　　1  CD?DST的技术原理及特点

　　1.1  CD?DST的原理  肿瘤细胞生长的空间是由周围肿瘤细胞、正常细胞和细胞外基质共同构成，细胞本身的形态及生长微环境对细胞的生长和生物学行为有重要影响。Yang J等在1979年提出了一种新型体外细胞培养技术。原理就是利用胶原凝胶在37°C时形成三维立体结构的特点,将肿瘤细胞包埋到胶原中,在体外模仿体内的三维立体微环境,使肿瘤细胞能够在类似体内环境的情况下生长，最终形成与体内细胞相似的形态学特点。随后Miller等人证实这种新式培养方法具有成功率高,与体内细胞形态相似的特点。Kobayashi H等人对这种方法进行深入研究，结合科学技术，建立了CD?DST体外药敏检测技术，并阐明该技术的特点［2?4］:

　　1.1.1  细胞培养成功率高  肿瘤细胞通过胶原凝胶在体外达到三维立体培养模式，具有成功率高，形态同体内细胞相近的特点，同其他常规方法比较，这种体外立体培养的细胞其形态和生物学特性更接近体内细胞。

　　1.1.2  同其他方法现比，该技术所需细胞量更少，临床上可采用胸腹腔积液［3］、活检组织切片进行敏感性试验，扩大肿瘤药敏技术的检测范围。

　　1.1.3  利用细胞的生长要求和形态差异，结合图像识别，软件分析，结果可靠准确  在细胞培养过程中，一个常见的问题是成纤维细胞的干扰。Kobayashi H等［4］人基于肿瘤细胞和成纤维细胞对血清的要求不同，采用无血清培养方式，抑制成纤维细胞生长，终末步骤经中性红染色，根据两种细胞在形态和色度上的明显差异，依靠图像软件技术，设定界值，加以区分，使结果准确可靠，可操作性强。

　　1.1.4  通过曲线下面积药物浓度，更接近体内实际情况  通过药物浓度和时间关系曲线，评估有效用药剂量，为临床科学合理用药提供指导。

　　1.1.5  临床相关性好  Kobayashi H［2］的一篇回顾性文章表明：在预测精确值84.1％（154/183）情况下，阳性预测值79.8％（75/94）、阴性预测值88.8％（79/89）、敏感性88.2％（75/85）、特异性80.6％（79/98）。

　　1.1.6  结果测定快速（3秒/滴） 借助计算机分析，测定6种药物所需时间只需1min。

　　1.2  简要操作流程包含如下4个部分［3，5］

　　1.2.1  第一部分：胶滴肿瘤细胞培养阶段。肿瘤组织经机械分离后，用0.25％胰消化酶消化，160目筛网过滤→单细胞悬液→包埋到Ⅰ型胶原中培养24小时后，消化收集活细胞→洗涤，离心计数→同胶原凝胶混合物混合，接种到六孔板，形成胶原细胞胶滴，在ph值中性和室温下凝成凝胶。

　　1.2.2  第二部分：药物处理阶段。将待测药物添加到六孔板中，作用24小时，洗去药物。

　　1.2.3  第三部分：无血清培养阶段。加入不含血清的培养液，继续培养7天。

　　1.2.4  第四部分：计算机结果分析。最后标本染色、甲醛固定，利用图像处理软件对结果进行分析。

　　2  CD?DST技术在大肠癌的临床治疗和科研中的应用

　　2.1  根据多点体外药敏试验结果，探索最佳个体化治疗方案  作为一种简单、快速、敏感、临床相关性较好的体外药敏试验技术，可以有助于临床医生科学、合理选择有效药物，优化药物组合，提高临床疗效，降低毒副作用。如氟尿嘧啶（5?FU）是一种大肠癌化疗一线敏感性药物，临床应用相当广泛，但作为单药有效率不到20％，即使联合用药，有效率也只有40％左右。Ochiai等［6］人利用CD?DST技术，对53例结直肠癌患者肿瘤细胞在体外进行分组，将氟尿嘧啶（5?FU）设计成不同药物浓度/接触时间的状况，通过测定其对肿瘤细胞的生长抑制情况，确定合理的临床用药剂量，或给予药物调整建议。
   
　　鉴于单药有效率低，目前化疗方案通常采用联合化疗形式，以增加疗效，降低毒副作用。Mori S等［7］人通过CD?DST对氟尿嘧啶（5?FU）和顺铂（DDP）联合化疗方案对40例晚期胃肠道肿瘤患者的疗效进行评价，结果表明: 氟尿嘧啶（5?FU）和顺铂（DDP）相互之间有协同增效作用，增幅1.10～2.01左右，两者各自都有诱导细胞死亡的功效。说明通过体外药敏技术，可为选择合理有效的化疗方案提供指标。

　　2.2  评价各种化疗药物的临床敏感度，有利于确立一线治疗药物  CD?DST作为先进的药敏检测技术，在筛选对大肠癌敏感的药物过程中，提供良好的检测平台。Araki Y等［8］人以CD?DST技术，对24位Duke B、C期大肠癌病人的肿瘤细胞进行培养，样本可评价率为87.5％（21/24）。体外抗癌敏感度依次为：阿霉素（adriamycin ADM）60.4%；依托泊苷（etoposide VP?16）58.9%; 顺铂（cisplatin DDP）56.7%; 氟尿嘧啶（5－fluorouracil 5?FU）53.4％；丝裂霉素C(mitomycinC MMC)31.1%; 长春花碱酰胺（vindesine VDS）9.5％。随着检测样本的扩大，范围的拓宽，CD?DST技术凭借自身优势在药物筛选领域的作用将益发重要。

　　2.3  为新型抗癌药物的试验型研究提供帮助  CD?DST药敏技术可应用于新药的开发工作中，探讨药理机制和疗效。Mori T等［9］人通过CD?DST技术评估一种名为paradicsopaprika的食用植物的水性提取物（TOMA?P），结果发现对肿瘤细胞有一定抑制作用，并能诱导静止期肿瘤细胞，可作为一种新型抗癌药物加以进一步研究。

　　2.4  可进行与大肠癌相关的基础研究  个体对化疗药物的敏感性和肿瘤细胞自身酶学活性之间的关系，目前正成为学者研究的热点问题。Araki等［10］人通过CD?DST技术对51例结直肠癌患者的样本进行检测，探讨了在体外对5?FU敏感的肿瘤细胞与胸腺嘧啶核苷酸合成酶thymidylate synthase (TS)和二氢嘧啶脱氢酶dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD)的关系。结果表明：TS和DPD二者同5?FU敏感性之间相关性不强，简单线性回归显示：同DPD（r=-0.267, P>0.05）；TS (r=-0.277,P>0.05)。Ochiai T［11］和Fujii R［12］等人利用CD?DST技术对5?FU敏感的大肠癌肿瘤细胞同肿瘤酶学指标的关系进行了研究，结果表明：OPRT（orotate phosphoribosyl transferase）的活性同肿瘤细胞5?FU敏感性之间正相关。能否可作为预测5?FU敏感性的有用指标，还有待进一步研究。但有学者［13］对上述结果表示异议。该领域还需进行大量研究。
   
　　对于热门的耐药基因(multidrug resistance,MDR1)和多耐药相关蛋白（MDR associated protein, MRP）组的研究，Nakahara T［14］等人利用CD?DST技术对25例大肠癌样本进行检测，样本可评价率16/25,结论：抗癌药物对增殖性高的肿瘤作用强，但药物敏感性同MDR1和MRP1相关性不强。由于样本不大，二者相关性研究还需进一步探讨。

　　3  展望
   
　　根据Cline在1996年提出的理想的药敏试验应具有的条件：简单、快速、敏感、可筛选不同作用方式的药物、与临床有良好的相关性。CD?DST的出现，较以前的药敏试验，无疑是一个进步。作为一种先进的体外药敏检测技术，在临床和肿瘤的相关研究中有过成功的报道［15?16］。但主要在肺癌和妇科肿瘤中多见。大肠癌中的应用还有待拓宽。
   
　　已有的研究表明，CD?DST技术克服了既往药敏试验技术的一些缺陷，在细胞培养成功率、小样本检测、抗干扰、敏感度上有较大突破，使临床大肠癌患者的个体化治疗成为可能。

【】
  　　［1］ Kobayashi H. Collagen gel droplet culture method to examine in vitro chemosensitivity［J］.Methods Mol Med，2005，110(1):59?68.

　　［2］ Kobayashi H. Development of a new in vitro chemosensitivity test using collagen gel droplet embedded culture and image analysis for clinical usefulness［J］.Recent Results Cancer Res，2003，161(1):48?61.

　　［3］ Kawaguchi M, Banno K, Susumu N, et al. Successful analysis of anticancer drug sensitivity by CD?DST using pleural fluid and ascites from patients with advanced ovarian cancer: case reports［J］. Anticancer Res，2005，25(5):3547?51.

　　［4］ Kobayashi H, Higashiyama M, Minamigawa K, et al.Examination of in vitro chemosensitivity test using collagen gel droplet culture method with colorimetric endpoint quantification［J］. Jpn J Cancer Res，2001，92(2):203?10.

　　［5］ 梁智， 田海梅，李艳芬，等.胶滴肿瘤药敏检测技术（CD?DST）的建立及.初步临床应用研究［J］.癌症进展杂志，2006，4（6）：545?549.

　　［6］ Ochiai T, Nishimura K, Noguchi H, et al.Evaluation of 5?fluorouracil applicability by multi?point collagen gel droplet embedded drug sensitivity test［J］.Oncol Rep，2005，14(1):201?5.

　　［7］ Mori S, Kunieda K, Sugiyama Y, et al.Prediction of 5?fluorouracil and cisplatin synergism for advanced gastrointestinal cancers using a collagen gel droplet embedded culture［J］.Surg Today，2003，33(8):577?83.

　　［8］ Araki Y, Isomoto H, Matsumoto A, et al. An in vitro chemosensitivity test for colorectal cancer using collagen?gel droplet embedded cultures［J］.Kurume Med J，1999，46(3-4):163?6.

　　［9］ Mori T, Ohnishi M, Komiyama M, et al.Growth inhibitory effect of paradicsompaprika in cancer cell lines.Oncol Rep，2002，9(4):807?10.

　　［10］Araki Y, Isomoto H, Shirouzu K.Dihydropyrimidine dehydrogenase activity and thymidylate synthase level are associated with response to 5?fluorouracil in human colorectal cancer［J］.Kurume Med J，2001，48(2):93?8.

　　［11］Ochiai T, Sugitani M, Nishimura K, et al. Correlation between 5?fluorouracil (5?FU) sensitivity as measured by collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test (CD?DST) and expression of orotate phosphoribosyl transferase (OPRT), thymidylate synthase (TS), and dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) in colorectal cancer ［J］. Gan To Kagaku Ryoho，2001，28(5):661?7.

　　［12］Fujii R, Seshimo A, Kameoka S.Relationships between the expression of thymidylate synthase, dihydropyrimidine dehydrogenase, and orotate phosphoribosyltransferase and cell proliferative activity and 5?fluorouracil sensitivity in colorectal carcinoma［J］.Int J Clin Oncol，2003，8(2):72?8.

　　［13］Yamada T, Tanaka N, Yokoi K, et al.Prediction of sensitivity to 5?fluorouracil (5?fu) by metabolic and target enzyme activities in colon cancer［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2006，33(11):1603?9.

　　［14］Nakahara T, Sakaeda T, Nakamura T, et al.Chemosensitivity assessed by collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test, and MDR1, MRP1, and MRP2 mRNA expression in human colorectal adenocarcinomas［J］.Pharm Res，2004，21(3):406?12.

　　［15］Kawamura M, Gika M, Abiko T, et al.Clinical evaluation of chemosensitivity testing for patients with unresectable non?small cell lung cancer (NSCLC) using collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test (CD?DST)［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2007，59(4):507?13.

　　［16］Yamagami W, Banno K, Kawaguchi M, et al.Use of the collagen gel droplet embedded drug sensitivity test to determine drug sensitivity against ovarian mature cystic teratoma with malignant transformation to adenocarcinoma: a case report［J］.Chemotherapy，2007，53(2):137?41.