白念珠菌生物膜对卡泊芬净的敏感性研究

                作者：张洁 张莉 白秦玉 陈光仍

【摘要】  目的 探讨新生白念珠菌生物膜对卡泊芬净的敏感性。方法 建立白念珠菌生物膜模型，采用标准化念珠菌生物膜抗真菌药物敏感实验法测定白念珠菌生物膜对卡泊芬净和两性霉素B的敏感性。结果 30株白念珠菌生物膜中，6株对两性霉素B敏感（SMIC80≤1μg／ml），24株对两性霉素B耐药（SMIC80＞1μg／ml）；28株对卡泊芬净敏感（SMIC80＜ 16μg／ml），2株对卡泊芬净耐药(SMIC80≥16μg／ml)。经统计学分析，就白念珠菌生物膜的对抗真菌药物的敏感性而言，卡泊芬净和两性霉素B之间有统计学意义（χ2=32.86,P<0.05）。结论 白念珠菌生物膜对两性霉素B耐药明显，而对卡泊芬净敏感。 张洁（1980～），女，汉族，山西籍，青海大学医学院2005级研究生

【关键词】  白念珠菌 生物膜 卡泊芬净 两性霉素B

    STUDY ON THE SUSCEPTIBILITY OF CASPOFUNGIN

    AGAINST BIOFILMS OF CANDIDA ALBICANS

    Zhang Jie1 , Zhang Li2,Bai Qinyu2, et al.

    (1.Department of Medicine college in Qinghai University；

    2. Department of Dermatology, the Affiliated Hospital of Qinghai University )

    Abstract  Objective  To study the sensitivity of new Candida albicans biofilms to caspofungin. Methods  Candida albicans biofilms model was established and evaluated sensitivity of Candida albicans biofilms to amphotericine B and caspofungin by Standardized Method．Results  Among of thirty Candida albicans biofilms strains,, six were sensitive to amphotericine B（SMIC80≤1μg／ml）, twenty-four were resistant to amphotericine B（SMIC80＞1μg／ml）.twenty-eight were sensitive to caspofungin（SMIC80＜ 16μg／ml）; two were resistant to caspofungin (SMIC80≥16μg／ml). After statistical analysis, there was significant difference between caspofungin and amphotericine B （χ2=32.86,P<0.05）. Conclusion Candida albicans biofilms are obviously resistant to amphotericine B and relatively sensitive to caspofungin.

    Key words  Candida albicans  Biofilms  Caspofungin  Amphotericine B

    生物膜（biofilm）是指附着于无活力或活组织表面的、由其自身产生的细胞外基质包裹的有结构的菌细胞群体，是相对于单个分散的游离状态菌细胞而言的另一种微生物独特的生存形式［1］，其主要特征是具有高度耐药性［1～3］。卡泊芬净（caspofungin, CAS）是第一个被美国食品与药品管理局批准上市的棘球白菌素类抗真菌药物，是一种β-（l，3）-D-葡聚糖合成酶抑制剂，可特异地抑制真菌细胞壁的组成成分β-（l，3）-D-葡聚糖的合成。主要用于其他抗真菌治疗无效或不能耐受的念珠菌和曲霉感染。其高效安全，患者耐受性好，目前国内外逐渐开始广泛应用，是一种很有前途的系统性抗真菌药物［４］。本研究通过标准化的念珠菌生物膜抗真菌药物敏感实验法检测卡泊芬净对抗白念珠菌生物膜的作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  药物

    两性霉素B（amphotericin B ,AMB，上海新先锋药业公司提供，批号070103），CAS(默沙东制药有限公司提供，批号J3930）。

    1.1.2  试剂

    “甲基四氮盐（XTT）-维生素K3（menadione）”溶液：XTT粉末(Sigma公司)用林格液稀释（0．5 g／L）后用0．22 μm孔径的滤器过滤消毒；维生素K3 (Sigma公司)用丙酮稀释（10 mmol／L）；将维生素K3加入到XTT溶液中，致其终浓度为1 μmol／L，现配现用。

    1.1.3  菌株 

    白念珠菌株30株，均来源于上海长海真菌室收集的临床标本。将白念珠菌接种到沙堡琼脂糖培养基（sabouraud's dextrose agar，SDA）上，在37℃环境下过夜。挑取单克隆菌株，加入到1 ml酵母蛋白葡萄糖液基（yeast peptone dextrose，YEPD）中活化，在摇床（30℃，100rpm）上培养24 h；取10 μl活化后的菌液，再次活化；取2次活化后的10 μl菌液，加入1 mlYEPD培养液，在摇床上(30℃，100rpm)培养16 h。经血细胞计数器计数，将菌悬液的浓度配制为1.0×106 cfu/ml。传菌完毕后用80%甘油冻存白念珠菌。

    1.1.4  培养基

    SDA及YEPD常规配制；1640培养液：1640粉（Invitrogen 公司）10.40 g、三氮吗啡啉丙磺酸(Sigma 公司)34.53 g、碳酸氢钠2.0g加三蒸水900ml溶解,用氢氧化钠将pH值调至7.0，定量至1000 ml，过滤消毒，40℃保存备用。

    1.2  主要仪器 

    HZQ-F160全温振荡培养箱（太仓市实验设备厂），96孔培养板（美国costar公司），霉标仪（Labsytems Dragon）。

    1.3  方法

    1.3.1  药敏实验［5］

    将100 μl调整好的菌悬液接种于96孔培养皿中，在37℃环境下培养48 h，使念珠菌充分粘附在平底的由聚苯乙烯材料制成的96孔培养皿的基底表面，形成白念珠菌生物膜结构。各孔加样如下：第1列孔加入1640培养液100 μl，不加菌，作为空白对照；第2至11列孔各加新鲜配制的菌液100 μl；第12列孔加新鲜配制的菌液100 μl，不加药，作为阳性对照。弃去培养基及悬浮的菌悬液，加磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）200 μl充分混匀，冲洗3遍，最后用无菌滤纸将残余的PBS吸干，彻底去除没有黏附的白念珠菌。将2倍的药物浓度以倍比稀释的方法加到各孔中，继续在35℃环境下培养48 h。2～11号孔分别加入10级倍比稀释的3种药物，使AMB起始浓度为32 μg／ml，终末浓度为0.0625 μg／ml；CAS起始浓度为64 μg／ml，终末浓度为0.125μg／ml。各培养孔和对照孔中加入“XTT-menadione”溶液100μl，37℃环境下避光培养2 h。用霉标仪测定各孔的OD值（波长为490nm），通过该值来确定抑制80％固着性白念珠菌生物膜生长的最小药物浓度 ( sessile  minimal  inhibitory concentration，SMIC)。每个药物浓度均设2行，作为重复，取平均值。上述实验均平行操作2～3次，当SMIC80值能准确重复或者只差一个浓度梯度时才被接受，并且以较高浓度作为SMIC80值；当SMIC80相差两个浓度以上的时候，重新实验。

    1.3.2  结果判定

    药物的耐药程度判断（分界值）参照相关［4，6，7］。SMIC80是指与阳性对照孔比，OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度（即抑制80％固着性白念珠菌生物膜生长的最小药物浓度）。

    2  结果

    （见表1～2）  表130株白念珠菌生物膜对卡泊芬净和两性霉素B敏感性的SMIC80分布情况表230株白念珠菌生物膜对卡泊芬净和两性霉素B的敏感或耐药情况 注：经卡方检验分析，卡泊芬净和两性霉素B之间有统计学意义（χ2=32.86,P<0.05）.

    3  讨论

    本研究依据Ramage等［５］拟定的实验方法成功建立了白念珠菌生物膜模型。

    30株白念珠菌生物膜的SMIC80 显示，除6株白念珠菌生物膜对两性霉素B敏感(SMIC80≤1μg／ml)外，其余均对两性霉素B耐药（SMIC80＞1μg／ml）；只有2株对卡泊芬净耐药（SMIC80≥16μg／ml），其余28株白念珠菌生物膜均对卡泊芬净敏感（SMIC80＜ 16μg／ml）。 经卡方检验分析，在白念珠菌生物膜的敏感和耐药情况中，两性霉素B和卡泊芬净之间有统计学意义（χ2=32.86,P<0.05）。结果提示，白念珠菌生物膜对两性霉B明显耐药，仅20%的白念珠菌生物膜对两性霉素B敏感，与其他研究结果基本一致［3］；与两性霉素B相比，白念珠菌生物膜对卡泊芬净更敏感。

    目前，对细菌生物膜的研究已开展多年，而对真菌白念珠菌生物膜的研究还处在初级阶段，白念珠菌生物膜形成、耐药以及致病的机制等问题有待进一步探讨。本实验结果是一种理论性研究，与临床实际效果的一致性如何需要进一步探究。

    此外，在评价白念珠菌生物膜药敏结果时应具备以下意识：SMIC不是一个物理化学指标；在确定临床治疗效果时，宿主因素常常比药敏实验结果更为重要；体外药敏实验结果敏感，治疗并不一定成功；药敏结果显示耐药，常预示治疗失败。

【文献】
  ［1］ Douglas LJ.Candida biofilms and their role in infection. Trends Microbiol，2003，11(1): 30-36

［2］Donlan RM,Costerton JW．Biofilms：survival mechanisms of clinically relevant Microorganisms． Clin Microbiol Rev，2002，15(2)：167-193

［3］ Mukherjee PK,Chandra J. Candida biofilm resistance. Drug Resist Updat ,2004, 7(4-5): 301-309

［4］ Stone EA ，Fung HB，Kirschenbaum HL. Caspofungin：an echinocandin antifungal agent．Clin Ther，2002，24(3)：35l-377

［5］Ramage G,Walle KV，Wiekes BL，et a1．Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms［J］ ．Antimicrob Agents Chemother， 2001，45(9)：2475-2479

［6］ Serefko A, Chudzik B, Malm A. In vitro activity of caspofungin against planktonic and sessile Candida sp. cells. Pol J Microbiol， 2006,55(2):133-137

［7］李秀丽，李凌，廖万清.新生隐球菌生物膜体外抗真菌药物敏感性研究［J］.皮肤性病杂志,2007，21(8)：452-454