P16和nm23-H1在乳腺癌组织中的表达及其意义
【摘要】 目的 探讨新型抑癌基因P16和肿瘤转移抑制基因nm23-H1在乳腺癌中的表达及其与临床病理因素的相关性。方法 应用免疫组织化学SP法检测50例乳腺癌手术标本和25例乳腺纤维腺瘤标本（阴性对照组）中P16和nm23-H1的表达，通过光学显微镜观察免疫组织化学表达情况并应用统计学方法对结果进行分析。结果 P16的阳性表达率在乳腺癌组明显低于对照组（P＜0.05）。nm23-H1的阳性表达率在阳性组和对照组间比较无显著性差异（P＞0.05）。在乳腺癌中，nm23-H1的阳性率在各临床分期组间比较有显著性差异(P＜0.01)；P16和nm23-H1的阳性率在各组织学分级组间比较有显著性差异(P＜0.01)； nm23-H1和P16的阳性表达率在有无淋巴结转移组之间比较有显著性差异（P＜0.05）。结论 联合检测乳腺癌组织中P16和nm23-H1的表达状况有助于判断预后。
【关键词】 乳腺癌 P16 nm23-H1 免疫组织化学
EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF P16 AND
Abstract Objective To study the expression of growth suppressor gene P16 and nm23-H1 and their correlation with clinical pathological factors in breast cancer. Methods S-P method of Immunohistochemistry was applied to detect the expressions of P16 and nm23-H1 in 25 cases of breast fibroadenoma and in 50 cases of breast cancer. The staining result was observed by optical microscope. Results The positive expression rate of P16 (48%) in breast cancer was statistically lower than that in fibroadenoma(88%) . while nm23-H1 (58%) was also lower than that in fibroadenoma(72%) and showed no significance (P>0.05). The positive expression rate of P16 and nm23-H1 were significantly associated with histological grading (P<0.01).The positive expression rate of P16 and nm23-H1 were significantly associated between with or without lymph node metastasis（P<0.05）.The expression of nm23-H1 was significantly associated with TNM stage(P<0.01). Conclusion It could help to judge patients′prognosis by jointly detecting the expression rate of P16 and nm23-H1 in breast cancer.
Key words Carcinoma of breast P16 nm23-H1 Immunohistochemistry
本文应用免疫组化方法对乳腺癌进行P16和nm23-H1表达的检测，并分析二者的表达与乳腺癌临床病特征及其与乳腺癌患者预后的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
随机选取2000～2001年在青海大学附属病理科保存的手术切除后的乳腺癌病理标本50例。患者年龄25～65岁，中位年龄45岁。标本中髓样癌5例、小叶原位癌4例、浸润性导管癌41例；伴有淋巴结转移的24例。乳腺癌全部病例术前均未接受放疗或化疗，术后进行常规化疗。随机选取2000～2001年青海大学附属医院病理科保存的乳腺纤维腺瘤病理标本25例作为病理对照组,患者年龄17～44岁，中位年龄30岁。
1.2 方法
免疫组化技术采用链霉素-生物素免疫组化法即SP法，将标本做常规石蜡包埋后连续切片（4μm）,脱蜡，水化，用PBS冲洗（10min×3times）；滴加一抗（P16抗体和nm23-H1抗体），4℃孵育过夜，PBS冲洗（10min×3 times）；滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗（10min×3 times）；DAB显色，37℃孵育30 min，PBS冲洗（10min×3 times）；自来水冲洗，苏木精浅染，自来水冲洗反蓝，梯度酒精脱水，透明化，中性树胶封固。用PBS代替Ⅰ抗作阴性对照，用已知阳性染色切片作为阳性对照。
1.3 结果判定方法 ［1，2］
P16阳性细胞为胞浆中出现的棕黄色颗粒。整个切片未见细胞染色或着色细胞数≤10％记为阴性(－)；着色细胞数＞10％记为阳性（+）。
nm23-H1阳性细胞为胞浆着棕黄色，整个切片未见细胞染色或着色细胞数在20%以下为记为阴性(－)，着色细胞数≥20%记为阳性（+）。
1.4 统计学方法
所有数值采用SPSS10.0软件包进行χ2检验。P＜0.05视为具有显著性差异，有统计学意义。
2 结果
2.1 乳腺癌和乳腺纤维腺瘤中P16和nm23-H1的表达情况（见表1）
表1P16和nm23-H1在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤中的表达表2乳腺癌中P16和nm23-H1的表达与临床病理因素的关系
P16阳性表达率在患者的不同发病年龄、肿瘤大小、病理类型各组间，临床分期各组间比较无显著性差异(P＞0.05)。组织学分级越高，P16的阳性率越低，各组间比较有显著性差异(P＜0. 01)。无腋窝淋巴结转移组P16阳性率明显高于有腋窝淋巴结转移组。
nm23-H1的阳性表达率在患者的不同发病年龄、肿瘤大小﹑病理类型各组间比较无显著性差异(P＞0.05)。临床分期和组织学分级越高，nm23-H1的阳性率越低，各组间比较有显著差异(P＜0.01)。无腋窝淋巴结转移组P16阳性率明显高于有腋窝淋巴结转移组。
3 讨论
3.1 nm23-H1的表达及其意义
人类nm23基因中存在两个亚型，即nm23-H1H1和nm23-H2，其氨基酸序列具有88％的同源性，编码的蛋白产物为核苷二磷酸激酶(nuele．osidediphosphatekinase，NDPK)。该酶主要存在于细胞质和细胞膜上，是一种能催化多种反应并具有复杂生物学功能的酶。主要通过影响微管装配、信号传导、转译调节及细胞黏附而维持细胞的正常分裂状态，从而抑制癌细胞的转移［3］。nm23-H1低表达可引起系列氨基酸编码产物减少，导致系列信号传导异常，促进肿瘤细胞的生长、和转移。刘红等［4］认为nm23-H1基因表达与乳腺癌远处转移及腋淋巴结转移呈显著负相关，可作为一个独立的预测肿瘤远处转移的指标。本研究中nm23-H1基因在50例乳腺癌病人中的表达率与病人年龄、肿瘤大小及病理类型无关，但与临床分期、组织学分级及腋淋巴结转移情况有关。nm23-H1基因表达率研究有助于从乳腺癌患者中筛选出高危患者进行有针对性的。就本研究而言，有淋巴结转移组nm23-H1的阳性表达率较无淋巴结转移组低，说明该基因在恶性肿瘤发展中有丢失现象。nm23-H1表达率降低，则提示转移的可能性增大。因此，nm23-H1基因的低表达率既可以作为乳腺癌转移的标志，又可用来鉴定常规组织病不能确定的具有高转移潜能的肿瘤亚群，从而预测肿瘤的转移和复发。但在本研究中，nm23-H1的表达在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤之间无显著性差异，这与有些报道不一致。分析其原因可能与病例的选择、样本量的大小有关。
3.2 P16的表达及其意义
P16，又称MTS1（multiple tumorsuppressor 1)或CDKN2(cyclin-depedent inhibitor2)，是一种CDK4和CDK6的特异性抑制因子，其生物学行为与细胞周期的调控有关。P16能与CDK4或CDK6直接结合，抑制周期素D(cyclin D)与CDK4或CDK6结合形成复合物从而抑制其激酶活性，使RB蛋白不能被磷酸化，继续保持着与转录因子E2F的结合，从而阻止细胞从G1期进入S期，起到抑制细胞增殖的作用［5，6］。本实验中，P16蛋白的阳性表达率在不同年龄、病理类型、肿瘤大小、TNM分期各组间无显著性差异，但在组织学分级及有无腋窝淋巴结转移各组间有显著性差异。组织学分级越高，P16蛋白的阳性表达率越低，提示P16蛋白的表达缺失可能促进了乳腺癌细胞的增殖活性，并使其分化受阻。有腋窝淋巴结转移组P16蛋白的阳性表达率降低，提示P16蛋白在抑制乳腺癌经淋巴道转移中发挥着一定的作用。
3.3 P16与nm23-H1间的内在联系
本研究显示，随着分化程度的增高，P16和nm23-H1的阳性率都增高，说明P16和nm23-H1的表达在乳腺癌的分化过程中发挥着重要作用。无淋巴结转移者P16和nm23-H1的阳性表达率明显高于有淋巴结转移者，说明P16和nm23-H1在乳腺癌的淋巴道转移机制上的确存在着一定抑制效应。研究表明P16的主要生物学功能是控制细胞增殖，其作用主要是通过与CDK4结合，拮抗CDK4的作用，阻止细胞由G期进入S期（DNA合成期）来实现的。而有证据也表明nm23-H1可与G期染色体单链核酸着丝粒的重复序列TTAGGG结合，参与基因转录的调节。由此可见，P16和nm23-H1在抑制肿瘤的增殖活性方面可能有协同作用。
综上所述，P16和nm23-H1的表达与乳腺癌的细胞分化、淋巴道转移关系密切。证明联合检测乳腺癌中P16和nm23-H1的表达的确有助于预后判断。
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