NeuroD对细胞分化的影响

【关键词】  螺旋-环-螺旋构型; 转录因子； 神经组织蛋白质类； 基因； 细胞分化

    神经源性分化蛋白(neurogenic differentiation,NeuroD)最早是通过酵母双杂交分析系统克隆出的一个新的碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-loop-helix,bHLH)家族成员［1］。其生物学作用广泛,除了在神经分化和发育过程中起着重要的作用外,还参与胰腺发育和β细胞分化,对体外培养的细胞系分化也有一定作用。而NeuroD基因敲除的小鼠出现神经系统的某些细胞死亡,可导致小脑、海马结构及内耳感觉神经节细胞的缺失,产生共济失调、耳聋等神经系统方面的功能障碍。笔者就NeuroD对细胞分化的影响方面做一综述,为临床相关疾病的提供新的思路。

　　1  NeuroD的来源

    碱性螺旋-环-螺旋基因(basic helix-loop-helix genes,bHLH)是发育过程中转录的重要组成部分,广泛参与神经和肌肉发生、细胞增殖分化、细胞谱系的决定、性别决定等基本生理过程。其特征结构域包括：一个螺旋-环-螺旋结构域(helix-loop-helix motif,HLH domain)及其上游短的碱性氨基酸结构域(basic domain)。bHLH蛋白主要以同源或异源二聚体形式与DNA上E盒(E-box)序列-CANNTG-结合而发挥功能［2］。

    根据其与DNA的结合模式,bHLH一般分为3类:(1)能够与E盒增强子序列结合的bHLH蛋白,包括肌浆蛋白(myogen D,MyOD)、神经源性分化蛋白(neurogenic differentiation,NeuroD)/弹力蛋白(atonal),少突胶质细胞因子(oligodendrocyte lineage genes,OLIG),神经原质蛋白(neurogenin,NGN)/Tap,Mash/achaete-scute,E-蛋白/少分裂细胞因子(daughterless);(2)能够与N盒(N-box)抑制子序列结合的bHLH蛋白,包括Hes/生毛蛋白(hairy)/断裂增强子［enhancer of split,E(SPL)］;(3)不与DNA结合的bHLH蛋白,有真内皮蛋白(intradermal,Id)和细胞外基质(EMC)［3］。

    bHLH蛋白的主要功能为调节各种干细胞向终末细胞的分化。它的高表达可促进干细胞分化,低表达则抑制干细胞分化,使干细胞处于持续增殖状态。它们在骨骼肌、果蝇的神经干细胞以及脊椎动物的脊髓、端脑皮层的发育过程中发挥着重要作用［4-7］。

    NeuroD作为bHLH家族的成员之一,主要作为一种分化因子,在前体细胞向成熟细胞转化的过程中起着重要作用。

　　2  基因结构与定位

    NeuroD基因位于小鼠2号染色体上,人类2号染色体长臂3区2带(2q32),长度约6 kb,包括2个外显子和1个内含子,其mRNA为2.6 kb,主要在大脑、肠和胰腺细胞中表达。其外显子1由168个碱基组成,编码部分mRNA的5’非翻译区(UTR);外显子2编码剩余部分的5’UTR、蛋白质编码区、3’UTR,蛋白质编码区仅位于外显子2上,在其基因中另发现有8个ATTTA区,为mRNA快速降解信号。与小鼠相比,人的NeuroD基因启动子区高度保守,包括2个转录起始位点(TSP),TATA盒位于距下游TSP约31 bp处,调控启动子活性元件位于邻近的408 bp区［8］。

    在小鼠和青蛙中,NeuroD主要在含有不完全分化神经元的组织中表达,如背神经节、听囊、视网膜、嗅上皮、嗅球、松果腺、小脑、海马和皮质。

　　3  NeuroD对细胞分化的作用

　　3.1  NeuroD对胰腺的作用 

　　NeuroD在小鼠脑中被发现的同时,另一组研究人员在仓鼠中克隆出胰岛素基因转录调控因子,被称为BETA2(β-cell E-box transactivator 2)。经Southern杂交证实,NeuroD与BETA2为同一转录因子。这一发现表明NeuroD在胰腺组织中也同样发挥其功能［8］。

　　3.1.1  NeuroD对胰腺发育的影响 

　　有实验证实,NeuroD对胰岛素基因的表达和调控有着重要影响［8-12］,动物实验也证实NeuroD对胰腺的发育过程起着至关重要的作用［13］。小鼠胚胎期9.5 d胰腺即已开始发育,一直到整个胰腺发育完成,在β细胞内均可测及NeuroD蛋白。出生后在所有成熟β细胞和少量α细胞内均见蛋白表达,但在δ和PP细胞内未测及蛋白。

　　3.1.2  作用机制

　　NeuroD属B类bHLH家族,它与A类bHLH蛋白E47形成二聚体后,高亲和力地与胰岛素基因的E盒结合,在胰岛β细胞中激活胰岛素基因的转录,对胰腺β细胞的发育及生理功能有着重要的作用［13］。在基因敲除小鼠中发现在孕17.5 d时β细胞大面积死亡,剩余细胞不足以形成胰岛。小鼠出生后5 d内就死于严重的高血糖症。基因敲除小鼠中可检出胰腺分泌的各种内分泌激素,但是胰岛素水平仅为正常的5%。α细胞同样有所减少,但不及β细胞明显。

    采用人类神经母细胞瘤细胞系(IMR-32)与仓鼠胰岛素肿瘤细胞系(HIT-T15)瞬时转染实验显示：NeuroD基因启动子区至少有3个正向调控元件,其中4个序列为CANNTG的E盒,分别称之为E1、E2、E3和E4盒。E1和E4盒与自身活化有关,尤其是E1更为重要;而E2、E3盒与自身活化无关,E3盒对于激活NeuroD基因转录有重要作用。总之,通过E盒序列,由NeuroD自身和另一E盒结合蛋白正向共同调控NeuroD基因的表达。

    NeuroD家族成员除正向调控自身表达及交叉激活相互的表达外,同时还可激活下游基因转录,NeuroD指导的转录通过与许多下游基因调控区存在的DNA共有序列-E盒相互作用完成［14］,其具体机制还在探索之中。

　　3.1.3  NeuroD与糖尿病的关系 

　　NeuroD基因在人类2号染色体长臂3区2带(2q32)上,其基因定位邻近于1型糖尿病基因IDDM7(D2S152)位点处,人们对其基因变异与糖尿病的关系进行了一系列研究。结果发现：NeuroD基因45位密码子211核苷酸处G(A突变,导致氨基酸发生改变(Ala45(Thr),此变异在人与日本人群中与1型糖尿病密切相关［15-16］,而与2型糖尿病的关系尚不明确。

　　3.2  NeuroD与神经分化和发育的关系

　　3.2.1  NeuroD与神经系统发育 

　　外周神经系统的大部分结构在胚胎发育过程中存在NeuroD的瞬时表达。而在中枢神经系统结构,如皮质、海马、小脑和嗅球中,NeuroD的表达可维持到成年期。因而,在神经系统中NeuroD可能有两个表达时期,一个是在神经发生过程中的瞬时表达,另一个即已分化的成熟神经元中的持续表达［1］。Lee等也发现在人和小鼠的皮质和脊髓神经细胞分化时NeuroD mRNA表达达到高峰,而成熟后则下降,但在小脑和海马等部位mRNA则持续表达［17-18］。

    在非洲蟾蜍属胚胎中NeuroD异常表达能引起神经元前体提前分化,而且使上皮细胞转化为神经元;非洲蟾、斑马鱼或小鸡胚胎异位表达NeuroD、Ngn2或其他神经元bHLH蛋白也可引起神经元前体提前分化,因此认为NeuroD充当一种神经元分化基因,并能促使非神经细胞分化为神经元［1,19］。

    在基因敲除小鼠模型(NeuroD-null)中发现,除了有严重的糖尿病外,小鼠还表现出共济失调及转圈(head circling)等神经系统症状,小脑和海马中的颗粒细胞大量死亡［20-21］。进一步研究证实,前体颗粒细胞的发育与迁移,在缺少NeuroD情况下并未明显异常,但是一旦其迁移至海马齿状回后,细胞的增殖与分化受到明显抑制,从而导致细胞大量死亡。此外,在敲除NeuroD和MATH-2/NEX1基因的小鼠模型中,颗粒细胞无法分化成熟,膜上无法测及正常钠电流,同时细胞突起明显减少［22］。以上结果证实,NeuroD在神经发育与分化过程中起着重要作用。但是细胞未能分化成熟与细胞死亡间是否存在必然联系,NeuroD是否是通过促进细胞分化而使之存活下来,目前均不得而知。

　　3.2.2  NeuroD与内耳神经细胞 

　　NeuroD作为bHLH转录家族成员之一,在内耳的发育过程中起着重要作用。在小鼠孕9.5 d时内耳开始发育,感觉神经元和毛细胞开始大量增生,但直到出生后12-14 d才进一步发育成熟［23-26］。三种bHLH转录因子在内耳发育过程 中起重要作用［27］。Ngn1和Math1在发育的早期分别影响感觉神经元和毛细胞的形成［28-30］,而NeuroD在第二阶段,即细胞的成熟中起作用。在缺少NeuroD的条件下,耳蜗内的神经元几乎完全死亡,而前庭内的神经元也大量丧失,剩余的神经元也无法有序地将投射纤维联系于内耳感觉上皮细胞中。提示NeuroD在内耳神经元的发育与投射通路的建立中起着重要作用［31-32］。

　　3.2.3  NeuroD与视网膜 

　　NeuroD在小鼠视网膜发育早期的前体细胞中即已广泛存在,最后可发育为无长突细胞、感光细胞等终末细胞。NeuroD在其发育分化过程中起作用。在基因敲除模型中,无长突细胞明显减少且不能分化成熟［33-34］。而过度表达NeuroD后,又可使感光细胞明显增加。在小鸡基因干扰动物模型中,利用逆转录病毒载体在视网膜神经上皮和色素上皮中高表达NeuroD,可以使视锥细胞增生,而对其它细胞没有明显影响,而在基因敲除模型中,可使多种类型的视网膜细胞缺失从而严重扰乱光感受器的发生［35-36］。

    除了上述提到的神经细胞外,在边缘系统、下丘脑、大脑皮层和嗅觉神经元等细胞中均有报道见NeuroD的表达。但其在各类细胞中的作用还需进一步研究证实［37-42］。

　　3.3  NeuroD对体外培养细胞系的影响

    NeuroD在一定条件下可诱导间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)分化为神经干细胞、神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等［43］。在未分化的MSC中检测到NeuroD表达,表明这些细胞已经准备好向神经元分化［44］,在分化后数小时内NeuroD表达有所增高,但随着时间延长,其表达逐渐开始减弱。增加NeuroD表达可促进MSC分化为神经元。因此,未分化MSC表达NeuroD,分化后表达减低到没有表达,这和MSC转化为神经元相一致,也表明在分化后的神经元,其转录因子只是短暂表达［45］。Florian在诱导室管膜区细胞分化为少突胶质细胞和星形胶质细胞的实验中发现NeuroD表达也增高,同时发现NeuroD参与了其基因转录过程的调控,但其具体作用还未最后证实［46］。

    Farah等认为NeuroD的功能主要是调节诱导分化的神经元样细胞与细胞分裂的关系。通过小鼠胚胎肉瘤细胞(P19细胞)转染NeuroD的转录因子可以启动非神经细胞的神经分化。小鼠P19细胞瞬时表达NeuroD、MASH1、Ngn1或其他神经元bHLH蛋白,在无维A酸条件下可促使P19细胞向不同神经细胞分化,并且可诱导细胞周期的脱离、使细胞周期依赖激酶抑制物P27KIP1增高［47］。

　　4  展  望

    目前,通过基因敲除小鼠模型已初步了解到NeuroD在神经细胞和胰腺内分泌细胞的分化发育过程中起着重要作用。但还有许多方面尚未揭示其中奥秘,NeuroD的表达特异性就是其中之一。

    许多神经细胞发育过程中并未出现NeuroD表达高峰,如嗅细胞,但敲除NeuroD基因后却观察到此类细胞的大量死亡。NeuroD是第一个被发现可以调控胰腺内分泌细胞的发育和分化的神经转录因子,但在不同的遗传背景下NeuroD对胰腺细胞调控也存在着巨大差别［8］,是否有后续因子可以调控NeuroD的表达还尚未知。

    NeuroD蛋白水平的表达和调控也有许多问题悬而未决。Dufton通过修饰NeuroD蛋白羧基末端的丝氨酸残基可以使NeuroD蛋白表现出完全相反的功能［48］,其具体作用机制未清。

    对NeuroD调控区域是否存在突变、突变所产生的生理和病理作用及其调节细胞再生和凋亡信号平衡的机制,尚缺乏必要的认识,对此进行深入研究将有望为上述疾病的提供新的方向。

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