福州地区儿童急性呼吸道人类偏肺病毒感染

【摘要】  目的探讨人类偏肺病毒（HMPV）在福州市冬春季儿童急性呼吸道感染（ARTI）中的流行情况及其临床意义。方法86例年龄8个月～14岁ARTI患儿的咽拭子，用巢式逆转录聚合酶反应（RT?PCR）的方法检测脱落细胞的HMPV的M基因、呼吸道合胞病毒（RSV）的N基因。结果HMPV阳性19例(22.1%)，RSV阳性11例（12.8%）；其中3例HMPV与RSV均阳性。DNA测序显示，3份HMPV PCR产物核苷酸序列相同，与GenBank中的HMPV M基因片段核苷酸序列同源性88%～98%。结论HMPV是引起福州市儿童ARTI的常见病原之一。HMPV可与RSV合并引起ARTI。

【关键词】  人类偏肺病毒 呼吸道合胞病毒 呼吸道感染 急性病 序列分析 DNA 福州

   呼吸道病毒是引起小儿急性呼吸道感染（acute respiratory tract infections，ARTI）的常见病原。传统的呼吸道病毒有呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒等，约1/3患者的感染病原不明。2001年，荷兰家发现一种新的可引起人类呼吸道感染的副黏病毒?人类偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）[1]。目前HMPV已被认为是导致婴幼儿以及成人ARTI的重要病原。HMPV存在的两种基因型（A型与B型）均能导致ARTI[2?4]。为探讨HMPV与福州市儿童ARTI的关系，笔者对福州市ARTI患儿进行了HMPV的检测。

    1对象和方法

    1.1对象2005年12月～2006年4月因ARTI就诊的患儿，选择发病<2 d、未使用过任何抗病毒药物者86例：男性50例，女性36例，男∶女=1.39∶1，年龄（4.56±4.57）岁（8个月～14岁）。所有患儿符合ARTI的临床诊断标准[5]。

    1.2主要试剂及材料病毒核酸提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver.210)、Ex Taq DNA聚合酶为日本TaKaRa公司产品。A3500逆转录试剂盒为美国Promega公司产品。HMPV M基因引物由香港中文大学Paul KS Chan教授惠赠。RSV N基因引物[6]设计，大连宝生物工程公司合成，引物序列见表1。表1HMPV与RSV RT?PCR引物的寡核苷酸序列 HMPV:人类偏肺病毒;RSV：呼吸道合胞病毒;RT?PCR:逆转录聚合酶链反应；W:T或A.

    1.3病毒核酸提取及逆转录采集每例患儿咽拭子1份，将采集的咽拭子置入装有0.5 mL无菌生理盐水的EP管中洗涤。按照病毒核酸提取试剂盒及逆转录试剂盒说明书操作。

    1.4聚合酶链反应（PCR）（1）巢式PCR扩增HMPV M基因。PCR反应体系50 μL含dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，DNA模板200 ng， Ex Taq DNA聚合酶1.25 U。用Hema 240 基因扩增仪（珠海黑马医学仪器公司）进行PCR反应。第1次PCR：引物P1，P2各1 μmol/L；反应条件：95 ℃ 5 min→95 ℃ 30s→52 ℃ 40 s→72 ℃ 40 s，扩增40 个循环；72 ℃延伸10 min。第2次PCR：取第1次PCR反应产物1 μL，引物P3，P4各0.8 μmol/L；反应条件：95 ℃ 5 min→95℃ 30 s→54 ℃ 40 s→72 ℃ 40 s，扩增40 个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物为432 bp。（2）PCR扩增RSV N基因。引物P5，P6各1 μmol/L，其余成分同上。反应条件：95 ℃ 5min→95 ℃ 30 s→50 ℃ 40 s→72 ℃ 30 s，扩增40 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物为277 bp。

    PCR扩增产物用含0.5 μg/mL溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。对2种病毒各取3份阳性PCR扩增产物送大连宝生物公司做DNA测序。

    1.5统计学处理用SPSS 13.0软件进行χ2检验。核苷酸序列同源性及系统进化树比较用DNA MAN软件。

    2结果

    2.1PCR扩增琼脂糖凝胶电泳显示19份(22.1%)

    HMPV M基因扩增产物在432 bp处出现清晰条带。11份(12.8%)RSV N基因扩增产物在277 bp处出现清晰条带，其中3份标本2种病毒同时阳性（图1）。

    1，2：呼吸道合胞病毒（RSV）；M:100 bp DNA marker；3，4：人类偏肺病毒（HMPV）.

    图1HMPV M基因与RSV N基因 PCR产物电泳图(1.5%琼脂糖)

    Fig 1Electrophoretogram for the PCR products of HMPV M and RSV N genes (1.5% agarose)

    2.2PCR产物核苷酸序列测定与分析随机选取3份HMPV M扩增产物进行核苷酸序列测定，结果见图2。3份扩增产物的核苷酸同源性为100%。将其命名为FZ060405，并已登陆GenBank(Accession No:DQ887758)。

    同源性分析显示，此核苷酸序列与GenBank中多株HMPV同源性为88%～98%；其中与CS038（北京）、CAN00?13（加拿大）、BJ1816（北京）最接近，同源性为98%，氨基酸未改变;系统进化树分析也显示，与这3株进化簇接近，而与荷兰原型株001相距较远（图3）。3份RSV N基因扩增片段测序结果完全相同,并与GenBank中RSV记录DQ780564有97%一致。

    图2HMPV FZ060405株M基因PCR扩增片段测序结果

    Fig 2Sequencing result of PCR fragment from M gene of HMPV FZ060405

    AY145268.1：加拿大CNA00?13；  DQ843658.1：北京BJ1816; EF081358.1：北京CS038; DQ887758.1：福州FZ060405； AY525843.1：荷兰NL/1/99; EF081359.1：北京CS048; AF371337.2：荷兰00?1.

    图3HMPV M基因部分DNA序列系统进化树分析

    Fig 3Phylogenetic tree analysis of HMPV based on a part of sequence of M gene

    2.3HMPV与RSV感染的临床资料HMPV与RSV阳性病例在各年龄段的分布见表2。19例HMPV阳性病例中，男性10例（20%），女性9例（25%），男∶女=1.11∶1，与总样本的1.39∶1相比无统计学意义（χ2= 0.304，P>0.2）。HMPV与RSV感染的主要症状见表3。19例HMPV感染的临床诊断：细支气管炎4例(21%)，其中合并RSV感染1例；肺炎3例(15.8%)，其中合并RSV感染1例；上呼吸道感染12例(63.2%)。表286例急性呼吸道感染患儿各年龄段HMPV与RSV阳性率表3HMPV与RSV感染患儿的临床资料除年龄外,表中数据为例数(%).HMPV:人类偏肺病毒;RSV：呼吸道合胞病毒.

    3讨论

    HMPV与RSV是副黏病毒科肺病毒亚科中2种与人类ARTI有密切关系的病毒。自首次分离HMPV以来，欧洲、美洲、亚洲、非洲、澳洲的多个国家均报道在呼吸道感染患者中检出此病毒。目前该病毒已被认为在世界范围内广泛存在。HMPV检出率在冬春季节达高峰，可达30%左右[7?8]。我国的北京市及西南地区的重庆市也在冬春季节呼吸道感染患者中发现该病毒，检出率分别为30.0%与12.5%[7，9]。

    本研究中，86份标本有19例(22.1%)HMPV阳性，11例（12.8%）RSV阳性，其中3例HMPV与RSV均阳性，提示我国东南沿海地区同样有HMPV感染，且HMPV可具有比RSV更高的感染率，并可与RSV合并感染。分析显示，HMPV M基因片段与GenBank中北京及加拿大的HMPV同源性接近，而与荷兰原型株AF371337.2较远，反映本地区流行的HMPV与北京及加拿大的某些HMPV株可能来源于同一进化簇。

    HMPV多感染6个月～6岁儿童，但也可感染其他年龄段的儿童与任何年龄的成人[7?13]。本研究也显示，HMPV在3～5岁年龄段阳性率最高（24%），但在8个月～14岁的任何年龄段均可检出，说明HMPV均可感染各年龄段的儿童。HMPV引起的ARTI症状与RSV感染的临床症状相似，主要为发热、咳嗽、咽痛、哮喘等[1，4，11?13]，临床诊断主要为细支气管炎、肺炎、哮喘发作、上呼吸道感染等[7，9?11]。本研究结果与报道相似。值得注意的是，本组中1例5岁男性患儿初诊为麻疹，后检测HMPV阳性而确诊为HMPV引起的ARTI。有报道，HMPV感染患儿中男性多于女性，男∶女高达3∶1，显著高于被测总样本的1.2∶1[11]。但本组中无此现象（P>0.05)。

    HMPV的发现使10%～30%病原不明的ARTI患者明确了病原[7?10]。在健康幼儿未发现无症状的HMPV携带者，也没有充分的证据证明HMPV会长期停留于人体内[14]。鉴于HMPV的较高感染率，并且可使有免疫缺陷的病人发生重症肺炎导致死亡[4]，有必要对ARTI患者进行HMPV检测，以明确病原，预测临床过程，指导，避免临床不合理使用抗生素，且对ARTI的流行病学调查也有重要意义。

   【】


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