前列腺癌P504s、p63及34βE12的表达与Gleason分级的诊断意义
作者：张海萍， 钟山， 陈培琼， 郑菲
【关键词】 前列腺肿瘤；,角蛋白；,消旋酶类和差向异构酶类；,免疫组织化学;,肿瘤标记,生物学
摘要: 目的 探讨前列腺癌的病理形态学特征、Gleason分级及α甲酰基辅酶A消旋酶(P504s)、p63、34βE12联合标记在其诊断和预后中的应用价值。 方法 常规光镜观察71例前列腺癌患者的病理组织学形态并进行Gleason分级评分，应用免疫组织化学（SP法）检测P504s、p63、34βE12的表达。 结果 71例中，Gleason 2～4分11例，5～6分16例，7分16例，8～10分28例。P504s阳性表达率为97%（69/71），而p63和34βE12均不表达（0/71）。本组病例P504s、p63及34βE12在前列腺癌Gleason分组间的表达没有差异，与肿瘤的分化程度及生长方式也没有相关性。 结论 前列腺癌的病理诊断和Gleason分级评分主要是依据肿瘤的组织结构和形态学特征，Gleason分级与肿瘤的生物学行为和预后密切相关。P504s、p63、34βE12联合标记对前列腺癌的诊断和鉴别诊断有良好的应用价值。
关键词: 前列腺肿瘤； 角蛋白； 消旋酶类和差向异构酶类； 免疫组织化学; 肿瘤标记，生物学
随着国内人均寿命的延长、饮食结构的改变和诊断技术的提高，我国前列腺癌的发病率逐年显著提高，且预后不良，因此前列腺的早期诊断对和预后都至关重要。前列腺癌的诊断往往依赖于前列腺穿刺标本的病理检查，但由于活检标本取材有限、小而易于变形，仅仅靠光镜下的组织学形态有时很难鉴别，甚至造成误诊。目前分子生物学技术的已经证明，前列腺癌的发生、发展是多种癌基因和抑癌基因共同作用的结果，可以从蛋白水平和基因水平检测前列腺癌。近年研究发现，α甲酰基辅酶A消旋酶（P504s）在前列腺癌中具有高度特异度和敏感性，而p63、细胞角蛋白34βE12是目前基底细胞的可靠标记物[12]。为了在工作中更准确的认识和掌握前列腺癌的诊断，笔者通过对71例前列腺癌标本进行病理形态学观察、Gleason分级及免疫组织化学P504s、p63、34βE12联合标记，并结合临床情况探讨其相关性及诊断意义。
1 材料和方法
1.1 材料 收集2000年5月～2006年2月经病理明确诊断为前列腺腺癌标本71例(包括手术切除标本17例、经尿道前列腺切除21例及穿刺标本33例)。患者年龄（70.20±7.56）岁（52～83岁）。临床主要表现为局部尿道受压或直接被浸润所引起的排尿困难、血尿以及局部疼痛症状，部分病例病灶较小、局部症状不明显，以转移症状为首发症状，少部分病例没有任何临床症状、体检或做其他检查时偶然发现。
1.2 方法
1.2.1 常规病理观察 标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，常规HE染色。镜下观察所有病理切片中前列腺癌的形态结构、排列方式、间质变化及肿瘤浸润情况。
1.2.2 免疫组织化学方法 采用SP法，抗体、试剂盒和DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司，按说明书进行免疫组织化学染色。用已知前列腺癌切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，抗体包括P504s、p63及34βE12。
1.2.3 免疫组织化学结果判断 （1）P504s阳性信号定位于上皮细胞细胞质，呈棕黄色颗粒状。无着色细胞为阴性，着色细胞广泛分布为阳性；棕色颗粒稀少、细小为低表达，棕色颗粒密集，粗大为高表达。（2）p63阳性信号定位于基底细胞细胞核，呈深褐色颗粒，无棕色颗粒为阴性，有棕色颗粒为阳性。（3）34βE12阳性信号定位于基底细胞膜和细胞质，呈棕黄色染色为阳性，基底细胞缺乏无染色为阴性。
1.3 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件进行χ2检验,P＜0.05为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 病理组织学特点及Gleason分级 前列腺癌大多有结构异常，最常见是出现大量体积明显小于正常腺泡的圆形、卵圆形或不规则形腺泡，这种小腺泡可以聚集成腺瘤样，但缺乏正常的分叶结构。肿瘤可以呈边界较清楚、大致圆形的膨胀性生长的结节，结节内腺体排列紧密，间质较少，但每个腺体是独立的不融合、无浸润（GleasonⅠ级）；或在GleasonⅠ的基础上表现为结节局部向周围组织的微小浸润，结节内腺体结构、大小较不一致（GleasonⅡ级）；也可以在间质内弥漫浸润性生长，且腺体保持独立，其中筛状、乳头状和肾小球样结构最有诊断意义（GleasonⅢ级，又分为Ⅲa、Ⅲb和Ⅲc）。部分通过腺体的共壁，搭桥形成片状的融合性腺泡群即分化不良的腺癌结构（Gleason Ⅳ级，分为Ⅳa、Ⅳb）。其中分化最差的是非腺性结构，指实性团块、条索或单细胞结构，这时肿瘤已完全不呈腺样结构，常伴有坏死（Gleason Ⅴ级，分为Ⅴa、Ⅴb）。因此，结构异常，尤其是以小腺泡增生为特征的结构异常是诊断癌的重要依据，但少数前列腺癌是以大腺泡为结构特征，部分病例可以见到直径≥2.5 μm的大核仁。除了少数GleasonⅠ级癌以外，所有前列腺癌都有不同程度的浸润，尤以正常腺泡之间的间质浸润、神经浸润、腺外脂肪和横纹肌浸润，该组病例在前列腺高分化癌中有4例出现腺腔内黏液样物（图1a）、3例见到棒状类结晶体（图1b）、3例细胞质透亮似肾透明细胞癌，又称为hypernephroid结构（GleasonⅣb）(图1c)，在低分化癌中常常伴有肿瘤坏死。本组病例Gleason评分/总分2~4分11例，5~6分16例，7分16例，8~10分28例。
A:腺腔内见到淡蓝色黏液样分泌物;B:腺腔内见到致密、嗜伊红的棒状类结晶体;C:细胞质透亮似肾透明细胞癌，又称为hypernephroid结构(Gleason Ⅳb).
图1 前列腺高分化癌（HE染色 ×200） （略）
Fig 1 The high differentiating of prostate adenocarcinoma(HE staining ×200）
2.2 免疫组织化学表达 P504s阳性表达率97%（69/71），均为高表达（图2），在5～6分及8～10分中各有1例不表达（1/16，1/28）。p63和34βE12在71例中均不表达（0/71）。本组病例P504s、p63及34βE12在前列腺癌Gleason各组间的表达没有明显差异，与肿瘤的分化程度及生长方式无相关性（P＞0.05）。
细胞质呈棕黄色颗粒状.
图2 前列腺癌P504s呈弥漫性高表达（SP染色 ×200）（略）
Fig 2 P504s was diffuse applied in the prostate adenocarcinoma(SP staining ×200）
3 讨论
前列腺癌病诊断的重要依据是组织结构的紊乱，基底细胞层的缺乏和肿瘤浸润性生长及癌细胞大核仁的出现等特征。但由于前列腺结构形态及生物学行为较为复杂，尤其是在光镜下有时组织结构在某些非肿瘤性病变与肿瘤之间缺乏明显的界限，如高分化癌在组织学上与前列腺增生难以鉴别，以及常规切片有时不能判定基底细胞是否存在等。为了提高诊断的准确性，诊断时必须使用更客观、可靠的肿瘤特异性标记物。
3.1 Gleason分级在前列腺癌诊断中的应用 由于Gleason分级与前列腺癌的生物学行为和预后关联良好，其分级评分是以全部肿瘤的分化程度并兼顾生长方式及间质浸润状态为基础，还包含了同一前列腺癌标本中不同区域组织类型多样性的特点，故目前已成为前列腺癌方案的重要指标[35]。Gleason评分/总分=主要结构类别（级别）+次要结构类型（级别），其范围为2～10。目前认为Gleason评分可以划分为4组：2～4,5～6,7,8～10分。其中Gleason 2～4分相当于WHO Ⅰ级（高分化、低级别癌）、Gleason 5～7分相当于WHO Ⅱ级（中分化癌）、Gleason 8～10分相当于WHO Ⅲ级（低分化、高级别癌）。
由于本组大部分为穿刺及经尿道前列腺切除的标本（54/71），往往存在着组织挤压明显变形、小叶结构显示不明显，影响观察。按诊断标准，前列腺癌GleasonⅠ罕见，尤其是在针穿活检中诊断困难，因为GleasonⅠ～Ⅱ类型为“边界清楚的、膨胀性生长的结节”，通常较穿刺针直径大，其边界在针穿活检中难以确定。在诊断时，Ⅲc的筛状结构应与Ⅳa的筛状结构鉴别，后者特点是腺体融合，而前者的筛状结构是在较小的界限清楚的、外形光滑圆钝的腔内形成；Ⅲb的腺管管腔可非常小，需仔细观察与类型Ⅴ鉴别。在GleasonⅤ的病例中，单个肿瘤细胞分散浸润、切片染色太淡时，容易被忽略，其他级别肿瘤腺腔中可出现嗜酸性分泌物、中性粒细胞等，需与Ⅴa的肿瘤性坏死鉴别。本组资料GleasonⅢ、Ⅳ是最常见的类型。腺腔内黏液及棒状类结晶主要在低级别癌中出现，它们的出现在低级别癌和前列腺增生性病变的鉴别诊断中有重要价值。
大部分前列腺癌都有不同程度的浸润，神经浸润、腺外浸润和横纹肌浸润是诊断前列腺癌的重要形态学依据之一。尤其是穿刺活检的小标本，神经浸润往往提示肿瘤浸润范围已达到前列腺包膜外。
3.2 P504s、p63及34βE12在前列腺癌诊断中的价值 在前列腺癌的诊断中，确定基底膜的消失是可靠的指标。基底细胞特异性标记物34βE12及p63可用做有效的辅助诊断工具。许多学者的研究表明，部分前列腺增生、萎缩、腺病和不典型增生中34βE12或p63可有一些假阴性，二者协同使用优于各自单独使用，有学者在良性前列腺组织中用抗体34βE12和p63联合标记及34βE12、p63各自单独标记腺体的基底细胞，阳性率分别为94%，74%和87%[6]。有报道，应用cDNA文库减影法和微筛检法，发现P504s（AMACR）在前列腺癌中高度表达，而在正常前列腺中仅少量表达或无表达[1]。研究表明，P504s是前列腺癌高度敏感及特异性标记物，其阳性率为82%～100%[78]。本观察显示，P504s在前列腺癌中的阳性率为97%，与报道相近。但P504s在高级别的前列腺上皮内瘤中可以有80%以上的高表达，在前列腺非典型腺瘤样增生中也可显示不同程度的阳性反应，这说明P504s很难将高级别的上皮内瘤与前列腺癌相鉴别，也提示了高级别上皮内瘤是前列腺癌的癌前病变，并说明P504s在前列腺癌细胞的癌变过程中起着重要作用。故对病理诊断为高级别上皮内瘤的患者要密切随访和积极治疗。
P504s、p63及34βE12均可视为前列腺癌诊断较为敏感的特异性标记物，但由于它们的单独使用都具有一定的局限性，而联合使用可以极大的提高其诊断的准确性。P504s是前列腺癌诊断的阳性指标，而p63及34βE12是诊断的阴性指标，它们的联合使用可以从正反两方面互相印证结果。研究表明，P504s、p63及34βE12在前列腺病变病理诊断中的联合使用，结合其形态学特征可以基本上将前列腺癌同前列腺上皮内瘤及前列腺各种增生性病变相鉴别，而且可以较好提高微小癌灶的诊断率，弥补穿刺组织病理诊断的难点。P504s、p63及34βE12的表达与前列腺癌的Gleason分级评分、肿瘤的分化程度及生长方式没有相关性。
3.3 诊断 前列腺癌的病理诊断主要强调腺体结构的异常紊乱、细胞异型、明显的大核仁和组织浸润，在有结构异常的组织中应注意是否有腔内嗜碱性黏液、类结晶体，并观察结构异常的腺体基底细胞是否消失（p63及34βE12阴性）和P504s是否高表达来综合判断[9]。目前在临床前列腺病变的病理诊断中，笔者认为p63、34βE12和P504s是首选的一线抗体，P504s阳性和p63、34βE12阴性已经成为前列腺穿刺标本高分化癌和高级别上皮内瘤等癌前病变鉴别诊断的“金标准”。由于P504s本身没有组织的特异性，它在肝、肾、膀胱癌等中均有阳性表达，有时须同时使用前列腺原发标记物PAP、PSA来排除转移性肿瘤。必要时再结合MSA、S100、Syn、CgA、CD34、CD117等抗体来确定功能分类和鉴别是否为前列腺其他肿瘤。
笔者认为，在前列腺癌的诊断中，只要掌握了其病理形态学特点、Gleason分级原则并结合良好的免疫标记，基本上都能得到明确的病理诊断和Gleason分级评分。极少数确实难以判断良恶性的病例，建议临床作血清PSA随访，必要时重复穿刺取材。Gleason分级是判断前列腺癌分化程度的一个重要指标，与肿瘤的生物学行为和预后密切相关，Gleason评分低的前列腺癌患者预后好于评分高的患者，同时它也是治疗方案的重要依据，故诊断时病理医师要尽量给出准确的评分。
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