放射损伤对外源骨髓间充质干细胞迁徙定植的影响
【摘要】 研究机体中枢神经系统受放射损伤时骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）的迁徙定植特性的改变，从而为应用ＭＳＣｓ中枢神经系统放射损伤提供理论和实验依据。 【方法】用８周龄ＳＤ大鼠接受２２ＧｙＸ线照射制作枢神经系统放射损伤模型；从ＧＦＰ鼠抽取骨髓，分离和扩增ＭＳＣｓ。中枢神经系统受放射损伤的ＳＤ大鼠４个月后予静脉输注ＧＦＰ-ＭＳＣｓ。于移植后几个时间点取脑、骨髓、肝、脾等做冰冻切片，用双光子共聚焦红外脉冲激光显微镜检测ＧＦＰ-ＭＳＣｓ。 【结果】 在最早２４ ｈ内实验组和对照组的骨髓中检测到外源性ＧＦＰ阳性细胞，至第７天后实验组骨髓中ＧＦＰ阳性细胞显著多于对照组。脑内第１天未检测到外源性ＧＦＰ阳性细胞，第４天后中枢神经系统受放射损伤的ＳＤ大鼠，脑组织检测到带绿色荧光的外源性ＧＦＰ阳性细胞；而对照组脑内一直未检测到带绿色荧光的外源性ＭＳＣｓ。实验组和对照组脾脏在输注ＭＳＣｓ后第１天即检测到大量ＧＦＰ阳性细胞，并持续存在，第２１天实验组ＧＦＰ阳性细胞较对照组减少。【结论】 在放射损伤条件下外源性ＭＳＣｓ可透过血脑屏障到达脑组织，中枢神经系统放射损伤可诱导外源性ＭＳＣｓ向脑组织迁徙定植。
【关键词】 放射损伤 中枢神经系统 骨髓间充质干细胞
Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （ＭＳＣｓ） ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ｈｏｍｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔｓ ａｆｔｅｒ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ， ｔｏ ｓｅｅｋ ｔｈｅ ｃｕｅ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｉｒｒａｄｉａｔｉｎｇ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＣＮＳ） ｗｉｔｈ ＭＳＣｓ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｂｒａｉｎｓ ｏｆ ８-ｗｅｅｋ ｏｌｄ Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ２２ Ｇｙ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ ｏｆ Ｘ-ｒａｙ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｇｒｅｅｎ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＦＰ） ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ， ｅｘｐａｎｄｅｄ， ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｖ ｔｏ ＳＤ ｒａｔｓ ａｒｏｕｎｄ ４ ｍｏｎｔｈｓ ａｆｔｅｒ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ． Ａｔ ｃｅｒｔａｉｎ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ， ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｍｏｖｅｄ ａｎｄ ｆｒｏｚｅｎ． Ｃｒｙｏｓｔａｔ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ｐｈｏｔｏｎ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 ＧＦＰ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｕｎｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ ２４ ｈ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｎｏ ＧＦＰ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｂｒａｉｎｓ ａｔ ｅａｒｌｙ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ２４ ｈ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｉｔ ａｐｐｅａｒｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＧＦＰ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＣＮＳ ｏｆ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ＳＤ ｒａｔｓ ａｔ ｄａｙ ４ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｉｎ ｓｐｌｅｅｎｓ，ａ ｌｏｔ ｏｆ ＧＦＰ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ａｌｌ ｔｉｍｅ ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ２１ｓｔ ｄａｙ，ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＧＦＰ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】 Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｍａｙ ｅｎｈａｎｃｅ ｐａｓｓｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｌｏｏｄ-ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｏｆ ＭＳＣｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｈｏｍｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＳＣｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｒａｔｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ； ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ； ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ
随着干细胞工程研究的深入， 细胞替代治疗已成为治疗损伤、遗传缺陷性或退行性疾病的新途径。骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ） 是目前备受关注的一类来源于骨髓单个核细胞群， 具有多向分化潜能的组织干细胞。ＭＳＣｓ特性稳定，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。在体外特定的诱导条件下， ＭＳＣｓ 可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、韧带等多种细胞［１-４］。作为神经系统疾病细胞治疗的供体细胞应容易获得，能够迅速扩增，能够在宿主脑内长期存活，易于外源基因的转染和长期表达［５，６］。其中骨髓细胞是可能的来源之一。有实验表明［７］，骨髓单个核细胞能够穿过血脑屏障， 而且有助于小胶质细胞的正常转化。而在中枢神经受损伤的状态下，外源ＭＳＣｓ在体内的移行和定植特性尚未有研究报道。本文观察到机体中枢神经系统受放射损伤状态下ＭＳＣｓ的一些迁徙定植特性，可能为应用ＭＳＣｓ治疗中枢神经系统放射损伤和其他损伤提供实验依据。
１ 材料与方法
１．１ 实验动物与试剂
１．１．１ 实验动物
健康雄性Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ大鼠５０只，平均体质量２８０ ｇ，随机分放射实验组和对照组，每组分５个时间点。绿色荧光蛋白鼠１０只，平均体质量２２０ ｇ，作ＭＳＣｓ供体。实验动物均源自英国牛津大学实验动物部。
１．１．２ 实验试剂
含１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ公司）、胰蛋白酶、抗ＣＤ２９单抗、抗ＣＤ４４单抗、抗ＣＤ３４单抗、抗ＣＤ４５单抗（Ｓｉｇｍａ公司）、碘化丙啶（Ａｎｒｅｓｃｏ公司）。
１．１．３ 主要仪器
双光子共聚焦红外脉冲激光显微镜（８００ ｎｍ ｎｅａｒ ｉｎｆｒａ-ｒｅｄ ｆｅｍｔｏ-ｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅ ｌａｓｅｒ）（ＺＥＩＳＳ公司）、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０ 冷冻切片机（Ｌｅｉｃａ公司）、实验Ｘ线照射仪-５０ＭＡ（ＳＭＡＭ公司）、ＣＯ２培养箱（Ｆｏｒｍａ公司）。
１．２ 骨髓间充质干细胞分离与诱导
１．２．１ ＭＳＣｓ的原代培养
无菌条件下取绿色荧光蛋白鼠股骨骨髓，加入含有１．５ ｍＬ的１０％肝素液的离心管中，充分混匀。加入适量ＰＢＳ液混匀，以１ ０００ ｒ／ｍｉｎ （ｒ＝１５ ｃｍ） 离心１０ ｍｉｎ，吸净上液；再用ＰＢＳ液洗一遍（方法同前），用含１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清的完全培养液悬浮细胞，将其接种在２５ ｃｍ２培养瓶中，３７ ℃、体积分数５％ ＣＯ２、饱和湿度的ＣＯ２培养箱中原代培养。倒置相差显微镜下每日观察１次。原代ＭＳＣｓ（Ｐ０）约９０％贴壁细胞接近融合时，用ＰＢＳ冲洗２次以除去培养瓶中的含血清培养基。以适量２．５ ｇ／Ｌ 胰蛋白酶-ＥＤＴＡ室温消化１～２ ｍｉｎ（冬季室温较低，可放入温箱３７ ℃孵育３０ ｓ），倒置相差显微镜下观察，见到细胞变圆、间隙增宽、有部分细胞悬浮时即可加入含有血清的完全培养基终止消化。并用吸管轻轻吹打，使细胞进一步脱落。将细胞悬液移入无菌离心管中，以１ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃去上清，加入适量完全培养基悬浮细胞，将细胞悬液以１ ∶ ３接种于塑料培养瓶中，置ＣＯ２培养箱中继续培养。即为细胞Ｐ１代。待Ｐ１代细胞生长融合达９０％时，可继续传代［８］。
１．２．２ ＭＳＣｓ的鉴定
ＭＳＣｓ培养至Ｐ５代时，约９０％贴壁细胞接近融合时，用ＰＢＳ洗２次除去培养瓶中含血清的培养基，以适量０．２５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ室温消化１ ～ ２ ｍｉｎ倒置相差显微镜下观察，见到细胞变圆、间隙增宽、有部分细胞悬浮时即可加入含有血清的完全培养基终止消化。并用吸管轻轻吹打，使细胞进一步脱落。用ＰＢＳ洗２次后送流式细胞仪室检测ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ２９。
１．３ 放射损伤
５０只雄性ＳＤ鼠在１３周龄随机分成２组：实验组 脑局部接受Ｘ线照射；对照组作假照射。在乙醚麻醉下，实验组以１．４ Ｇｙ／ｍｉｎ的放射速率，接受２０ Ｇｙ的Ｘ线照射，Ｘ线透过一个在３ ｍｍ厚铅板上直径２０ ｍｍ的孔，保证大脑、小脑和脑干均接受Ｘ线照射，而其他部位免于Ｘ线照射［９］。该方法可以导致胼胝体、内囊等在照射后１６ ～ ２０周间发生迟发性坏死。
１．４ 间充质干细胞移植与检测
取扩增第５代的ＭＳＣ，去掉培养液，ＰＢＳ洗２遍，用１ ∶ １的２．５ ｇ／Ｌ的胰蛋白酶和０．２ ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ混合液消化，用含２０ ｇ／Ｌ ＢＳＡ的ＰＢＳ洗涤后制成浓度为１．０ × １０６／ｍＬ的单细胞悬液。每只实验鼠和对照鼠在２９周龄时（即放射处理后１６周），从尾静脉注入ＭＳＣ细胞悬液０．３ ｍＬ，细胞数３．０ × １０５。
移植后分别在第１天、第４天、第７天、第１４天、第２１天将２只实验鼠和对照鼠处死，取脑、肝、脾、肾、骨髓，标本置液氮后作冰冻切片，检测ＧＦＰ-ＭＳＣｓ在各组织的分布情况。切片以碘化丙啶染色（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ），用甘油封片，为减少荧光物质的光漂白作用，用双光子共聚焦红外脉冲激光显微镜（８００ ｎｍ ｎｅａｒ ｉｎｆｒａ-ｒｅｄ ｆｅｍｔｏ-ｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅ ｌａｓｅｒ）检测。
２ 结 果
２．１ ＭＳＣｓ的鉴定结果
培养至Ｐ５代的ＭＳＣｓ 生长旺盛、贴壁良好、呈均匀一致的旋涡状，移植前取１ ｍＬ细胞悬液用流式细胞仪检测细胞表面标志显示ＣＤ２９、ＣＤ４４阳性，ＣＤ３４、ＣＤ４５阴性。
２．２ 放射损伤结果
对实验组以１．４ Ｇｙ／ｍｉｎ的放射速率进行Ｘ线照射，造成海马和内囊变性。组织学检查显示，与对照组比较，实验组海马变性、神经元减少。
２．３ 间充质干细胞移植后迁徙和定植情况
移植后分别在第１天、第４天、第７天、第１４天、第２１天，取脑、肝、脾、肾、骨髓，作冰冻切片，用双光子共聚焦红外脉冲激光显微镜检测ＧＦＰ-ＭＳＣ在各组织的分布情况，每个样本数５个视野ＧＦＰ阳性细胞数，其平均值。结果显示：实验组和对照组在输注ＭＳＣｓ后第１天脑内均未检测到绿色荧光阳性的外源性ＧＦＰ阳性细胞。移植后第４天实验组海马出现ＧＦＰ阳性细胞，第７天最为明显；而对照组脑组织中未见有ＧＦＰ阳性细胞（图１），经秩和检验，两组差异有显著性。实验组和对照组在移植后第１天脾脏组织中出现大量的ＧＦＰ阳性细胞，并且一直持续至２１ ｄ，在第２１天对照组脾脏ＧＦＰ阳性细胞明显高于实验组，经ｔ检验差异有显著性。实验组和对照组骨髓均在移植后第１天即出现ＧＦＰ阳性细胞，但实验组多于对照组，经ｔ检验，在第７天、第１４天、第２１天两组差异有显著性意义。肝脏在输注ＭＳＣｓ后第１天即在实验组和对照组出现ＧＦＰ阳性细胞，之后各时间点均见ＧＦＰ阳性细胞，且实验组和对照组间差异无统计学意义（Ｐ﹥０．０５）。肾脏仅在第４天时间点出现ＧＦＰ阳性细胞，且两组间差异无统计学意义（Ｐ﹥０．０５，表１）。
３ 讨 论
神经元的特性决定了神经元在损伤坏死后难以再生。随着细胞移植研究的不断深入和应用，细胞替代已成为治疗损伤、遗传缺陷性或退行性疾病的新途径，使神经组织的再生成为可能。以往在神经领域的细胞移植研究多数用相应神经部位的直接注射，这种方法在动物实验有较好的可行性，但在临床应用时有很大的局限性和危险性。有实验表明［７］，骨髓单个核细胞能够穿过血脑屏障。根据这一特性，应用ＭＳＣｓ外周移植治疗中枢神经系统损伤存在着可能。本文在原有对放射性脑损害研究的基础上，观察中枢神经放射损伤对ＭＳＣｓ外周移植后迁徙定植特性的影响。
３．１ 外源性ＭＳＣｓ的迁徙
本研究显示在输注ＧＦＰ-ＭＳＣｓ后２４ ｈ内，实验组和对照组骨髓中均检测到ＧＦＰ阳性细胞，推测性ＭＳＣｓ可以直接向骨髓迁徙。比较放射照射组和对照组脑内ＧＦＰ阳性细胞可反映出外源性ＭＳＣｓ在中枢神经放射损伤下的迁徙特性。结果显示：放射照射组在外周输注ＧＦＰ-ＭＳＣｓ后第４天在海马区检测到ＧＦＰ-ＭＳＣｓ，第７天最为明显；而未受到放射照射的对照组，移植后脑内一直未检测到外源的ＧＦＰ阳性细胞。可见，一方面外源性ＭＳＣｓ有穿过血脑屏障的能力，这与以往报道相符［７］，但在对照组未见有外源性ＭＳＣｓ穿过血脑屏障到达脑组织，这说明只有在损伤等因素改变了血脑屏障特性使之一定程度开放的前提下，外源性ＭＳＣｓ才能穿过血脑屏障；另一方面，观察到外源性ＭＳＣｓ穿过血脑屏障后有向病损部位定向迁徙的特性。Ｅｇｌｉｔｉｓ 和Ｍｅｚｅｙ［１０］把成年雄性小鼠的骨髓或反转录病毒载体标记的骨髓移植给亚致死量放射线照射的雌性小鼠，３ ｄ 后便在受体雌鼠的脑内发现供体骨髓来源的神经细胞， 以后供体骨髓来源的神经细胞逐渐增多。原位杂交和免疫组化法检测发现， 供体骨髓来源的神经细胞表达小胶质细胞和星形胶质细胞的特异性标志。Ｓｏｎ ＢＲ等［１１］研究显示基质源因子-１（ＳＤ-１）有促进ＭＳＣｓ向受损组织迁徙的作用。
３．２ 外源性ＭＳＣｓ的定植
外源性ＭＳＣｓ在受体内的定植很大程度上决定于其在骨髓的定植情况。本研究显示：与对照组比较，实验组骨髓中外源ＧＦＰ阳性细胞明显增多。可见放射损伤有诱导外源性ＭＳＣｓ在骨髓的定植作用，其机理尚未明了，可能在放射损伤时存在趋化因子受体（ＣＸＣＲ４）的高表达，而后者有促进ＭＳＣｓ向骨髓中迁徙融合的作用［１１，１２］。此外，实验组和对照组从移植后第１天，脾脏均见大量ＧＦＰ-ＭＳＣｓ，两组无差异。这种现象一直持续至第２１天，两组脾脏仍可见大量ＧＦＰ-ＭＳＣｓ。可见，外源性ＭＳＣｓ移植后大量细胞将在脾脏被清除，而且这一状态一直持续，这关乎着外源细胞的永久定植的可能性。比较一致的研究结果是ＭＳＣｓ移植后具有免疫耐受性不会引起宿主的免疫排斥反应。有报道表明［１３，１４］， ＭＳＣｓ 和ＥＳ 细胞均表达组织相容性复合物Ⅰ而缺乏组织相容性复合物Ⅱ， 免疫原性较弱。但异体ＭＳＣｓ在受体内的远期归宿仍然没有定论。本研究显示实验组和对照组在各时间点都有大量ＧＦＰ-ＭＳＣｓ在脾脏持续存在，这是否是ＭＳＣｓ在受体中的归宿有待进一步研究。而在第２１天实验组脾脏中ＧＦＰ-ＭＳＣｓ较对照组显著减少，这是否提示经放射处理的大鼠在输注ＭＳＣｓ后，其后期ＭＳＣｓ的廓清减少而有利于ＭＳＣｓ定植？这一现象值得关注。
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