抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶单克隆抗体的制备及初步鉴定
【摘要】 制备均一性和特异性高的抗组氨酰-ｔＲＮＡ 合成酶抗体，为研究皮肌炎和多肌炎的检测提供方法，为制备检测试剂盒提供原料。【方法】 采用常规融合和间接ＥＬＩＳＡ检测法，获取杂交瘤细胞株；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０结合对含有单克隆抗体的腹水进行纯化；ＳＤＳ-ＰＡＧＡ电泳技术进行单克隆抗体的鉴定。【结果】 筛选获得了２株稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为Ｗ００１和Ｗ００２；杂交瘤细胞克隆后，１００％的检测孔保持了分泌抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体的能力；腹水纯化达到了较理想的效果；该２株单克隆抗体能特异性针对组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶，并能跟天然的蛋白结合。【结论】 所制备的均一性和特异性高的抗组氨酰-ｔＲＮＡ 合成酶抗体，可直接用于在ＥＬＩＳＡ、免疫印迹、免疫组化学等研究方面，达到了试验的目的。
【关键词】 组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶 抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶 单克隆抗体 鉴定
Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｎｔｉ-ｈｉｓｔｉｄｙｌ-ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｗｈｉｃｈ ｅｎｊｏｙ ｈｉｇｈ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ，ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ． Ｂｅｓｉｄｅｓ， ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｌｉｑｕｉｄ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｎｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ； ｔｏ ｐｕｒｉｆｙ ｔｈｅ ａｓｃｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｕｓｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０； ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ， ｎａｍｅｄ Ｗ００１ ａｎｄ Ｗ００２， ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｓｅｃｒｅｔｅ ａｎｔｉ-ｈｉｓｔｉｄｙｌ-ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｂｌｙ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｂｅｉｎｇ ｃｌｏｎｅｄ， １００％ ｃｈｅｃｋｉｎｇ ｈｏｌｅｓ ｋｅｅｐ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉ-ｈｉｓｔｉｄｙｌ-ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｃｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０， ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓａｔｉｓｆｙｉｎｇ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅｉｒ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｏｍｐｏｓｅ ｍｏｌｄ， ａｎｄ ｔｏ ｉｎｔｅｇｒａｔｅ ｗｉｔｈ ｎａｔｕｒａｌ ａｌｂｕｍｅｎ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｔｈｅ ａｎｔｉ-ｈｉｓｔｉｄｙｌ-ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｒｅ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＥＬＩＳＡ，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｅｔｃ． Ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ， ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａｃｈｉｅｖｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｉｓｔｉｄｙｌ-ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ａｎｔｉ-ｈｉｓｔｉｄｙｌ-ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体是一类结缔组织病中的多肌炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）和皮肌炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ，ＰＭ／ＤＭ） 的标志性自身抗体。ＰＭ／ＤＭ指横纹肌弥漫性炎症疾患，主要累及对称性的近端肢带肌，颈和咽部肌肉无力和萎缩，严重者导致心肌、呼吸肌群受累，引起死亡。只出现肌痛肌无力现象者称多肌炎；在多肌炎的基础上，出现典型皮疹者称皮肌炎。ＰＭ／ＤＭ是自身免疫性疾病，临床检验发现２５％ ～ ３０％的患者含抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体［１］（临床上又称抗Ｊｏ-１抗体），而其他抗合成酶抗体在ＰＭ／ＤＭ中的阳性率仅为１％ ～ ３％，其中ＰＭ的阳性率为３０％ ～ ４０％［２］，尤其是那些同时发生肺间质病变的患者［３］。许多研究者臻力于ＰＭ／ＤＭ的临床症状、诊断和的研究，并研发出了检测抗Ｊｏ-１抗体的试剂盒。但一直以来，对ＰＭ／ＤＭ病因的研究缓慢，报道极少，发病机理尚不清晰。本研究旨在制备均一性和特异性高的抗组氨酰-ｔＲＮＡ 合成酶抗体，为研究皮肌炎和多肌炎的检测方法提供依据，为制备检测试剂盒提供原料。
１ 材料和方法
１．１ 材料及试剂
组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶（ｈｉｓｔｉｄｙ１-ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ），由复旦大学生命院季朝能教授课题组提供；小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０细胞，由广州达瑞抗体工程技术有限公司实验室提供；Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，６ ～ ８周龄，雌性，体质量１８ ～ ２０ ｇ，购于广州中医药大学实验动物中心；ＨＴ、ＨＡＴ、８-氮鸟嘌呤购于Ｓｉｇｍａ公司；ＲＰＭＩ-１６４０粉剂购于ＧＩＢＣＯ ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；胎牛血清（ＦＢＳ）购于杭州四季青生物工程材料有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠ＩｇＧ购于Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、５-对氨基水杨酸、四甲基联苯胺（ＴＭＢ）购于Ｓｉｇｍａ公司；免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒购于ＨｙＣｕｌｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＨＢＴ）；聚乙二醇ＰＥＧ（１４５０）；低分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒ购于ＢＩＯ-ＲＡＤ。
１．２ 方 法
１．２．１ 动物免疫
按董志伟［４］方法进行小白鼠的初次、第２次和第３次免疫，获得免疫小白鼠。
１．２．２ 抗原最佳使用浓度的筛选
用间接ＥＬＩＳＡ检测法和方阵滴定试验法选择最佳抗原包被浓度，辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标记的羊抗小鼠ＩｇＧ作为二抗［４］。阳性血清（免疫小白鼠）自１∶１００起倍比稀释至１∶１２ ８００，各设两组阴性和空白对照，共１２组，依次加样（１００ μＬ／孔）、酶标二抗（５０ μＬ／孔）、底物（Ａ∶Ｂ＝１∶１混匀，５０ μＬ／孔）、２ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４（５０ μＬ／孔）。用酶标检测仪测定ＯＤ４５０值。
１．２．３ 杂交瘤细胞株的建立
获取复苏骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）进行细胞融合，ＥＬＩＳＡ法检测。先后进行亚克隆化和克隆化培养杂交瘤细胞，再扩大培养，用于制备腹水和冻存。用小鼠腹腔注射法制备腹水，再用Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ纯化和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０脱盐、筛选和建立杂交瘤细胞株［４］。
１．２．４ 单克隆抗体的鉴定
细胞培养上清效价测定：采用间接ＥＬＩＳＡ法，以免疫小白鼠的血清作阳性对照，以空白作阴性对照［４］。 抗体亚类鉴定：方法按免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒的说明进行。单克隆抗体的ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳［５］：分别取纯化后的单克隆抗体Ｗ００１和Ｗ００２的峰值蛋白进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳。单克隆抗体与抗原的免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）：①电泳（方法同单克隆抗体的ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳）：第１道为组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶 １０ μＬ，第２道蛋白Ｍａｋｅｒ１０ μＬ，一抗为细胞株Ｗ００１的上清液。②转膜条件：２０ Ｖ，３０ ｍｉｎ；２８０ ｍＡ，１２０ ｍｉｎ。在冰水中进行。③用５％的脱脂牛奶封闭，４ ℃过夜。④加细胞株Ｗ００２上清液，３７ ℃，６０ ｍｉｎ。加二抗，３７ ℃，６０ ｍｉｎ。ＥＣＬ显色。⑤压膜，拍片。单克隆抗体与天然蛋白的免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）：电泳方法同单克隆抗体的ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳。第１，２，３，４，５道依次上样蛋白Ｍａｒｋｅｒ １０ ?滋Ｌ空白，正常细胞２０ ?滋Ｌ，病变细胞２０ ?滋Ｌ，组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶１０ ?滋Ｌ。
２ 结 果
２．１ 抗原的最佳使用浓度
采用酶标检测仪测定ＯＤ４５０值，结果如表１。表中序号１ － ８为实验组，９ － １０和１１ － １２分别为阴性对照和空白对照组，Ａ、Ｂ、Ｃ分别表示浓度为０．００３ ｍｇ／ｍＬ、０．００４ ｍｇ／ｍＬ、０．００５ ｍｇ／ｍＬ的抗原用ＣＢＳ（小牛血清）。
用间接ＥＬＩＳＡ检测法筛选时，选择阳性血清和阴性血清的比值最大，且ＯＤ４５０值接近于１的抗原稀释度作为间接ＥＬＩＳＡ反应体系的最佳工作浓度。筛选杂交瘤细胞时用该体系对细胞上清液进行检测，当Ｐ／Ｎ≥２．１时，判为阳性。因此，表１结果显示：抗原的最佳使用浓度时０．００３ ｍｇ／ｍＬ，即小鼠阳性血清的最佳稀释度是１∶ ８００。
２．２ 杂交瘤细胞株的筛选和建立
杂交瘤细胞株筛选过程中的数据见表２。表中符号“＋、－”分别表示阳性和阴性。
经过上述试验方法，建立了杂交瘤细胞株分别为Ｗ００１和Ｗ００２，１００％检测孔保持了分泌抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体的能力，其融合率达９０％。
２．３ 单克隆抗体的鉴定
２．３．１ 细胞培养上清效价的测定
细胞培养上清效价的测定结果见表３。表中符号“－”表示“空白”。
表３结果显示：细胞株Ｗ００１上清效价为１∶１６００，细胞株Ｗ００２上清效价为１∶８００。
２．３．２ 抗体亚类的鉴定
抗体亚类鉴定的结果如图１。图１显示：细胞株Ｗ００１和Ｗ００２分泌的单克隆抗体亚类都是重链为ＩｇＧ１，轻链为κ。
２．３．３ 单克隆抗体的ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳
单克隆抗体的ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳结果如图２。
结果显示：腹水经Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ和ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０纯化后在电泳中基本没有杂带，纯化效果比较理想。
２．３．４ 单克隆抗体的特异性（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）
单克隆抗体与抗原的免疫印迹和单克隆抗体与天然蛋白的免疫印迹结果分别如图３、４。图３显示：细胞株Ｗ００１分泌的单克隆抗体能够与重组抗原结合。图４显示：细胞株Ｗ００２分泌的单克隆抗体能够跟重组抗原和天然蛋白结合，跟正常细胞中相比有一定的区别。但在病变细胞中，其特异性较低，出现了较多的非特异性条带，而且目的条带比一些非特异性条带弱。
３ 讨 论
ＰＭ／ＤＭ的特异性抗体是抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体，其抗原是组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶（ＨＡＲＳ），临床上称之为Ｊｏ-１。
组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶是胞内酶，由“管家”基因编码，可在所有的组织中表达。研究发现，抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体只能识别哺乳动物的ＨＲＳ 的抗原决定簇，不能识别原核生物和真菌分子［６］，但可以同时识别抗原上多个相关或相互独立的抗原决定簇［７］。有研究者认为，组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶分子上有３个抗原决定簇，其中两个分别位于氨基酸２-４４和２８６-５０９两个区域，而第３个抗原决定簇虽然没有确定其位置，但发现抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体可以抑制合成酶的活性。研究还发现，发生热变性的组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶分子不能与抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体发生免疫反应［８］，这意味着抗原决定簇对空间结构有一定的依赖性。
抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体主要作用于组氨酰-ｔＲＮＡ 合成酶并阻止组氨酰-ｔＲＮＡ与其同源氨基酸（组氨酸） 结合，同时聚集在酶的活性部位，与酶的多个部位发生作用而引起酶的构形损害，使合成酶失去活性。
实验结果表明：所获得的２个杂交瘤细胞株能稳定分泌阳性抗体，经克隆后，１００％的检测孔保持了分泌抗组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶抗体的能力，这与杨湘越等［９］通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中成功表达ＨＡＲＳ完全一致。该２个杂交瘤细胞株能与组氨酰-ｔＲＮＡ合成酶和天然蛋白结合，具有免疫原性和免疫特异性［１０］。另有研究表明，ＳＤＳ-ＰＡＧＥ和ＩＢＴ结果显示，融合蛋白分子量７５０００，具有天然人自身抗原Ｊｏ-１的免疫原性，成功克隆表达人自身抗原Ｊｏ-１［１１］。因而所制备的单克隆抗体可以用于亲和层析纯化抗原，可以在制备试剂盒时用于检测抗原，可以用于ＥＬＩＳＡ、免疫印迹、免疫组化学等研究方面，为建立ＰＭ／ＤＭ自身免疫抗体检测方法奠定了基础。但细胞株Ｗ００２分泌的单克隆抗体的特异性较低，以及对ＰＭ／ＤＭ的发病机理，有待进一步探讨。
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