胞内S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和 ER-α表达的关系

【摘要】  　　目的 探讨S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）升高抑制血管内皮细胞增殖和雌激素受体-α（estrogen receptor-α，ER-α）基因表达变化的关系。方法 以分离的原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）为研究对象，经不同浓度的SAH水解酶强效抑制剂3-deazaadenosine（DZA）处理24～72h后，反相高效液相色谱法测定胞内SAH浓度，利用细胞计数法、流式细胞仪和TUNEL技术检测细胞的增殖凋亡能力，Western blot法检测ER-α蛋白的表达，荧光定量-PCR检测其mRNA表达，甲基化特异PCR法检测ER-α基因启动子甲基化状态。结果 经DZA处理后，HUVEC胞内SAH浓度升高（P＜0.05），生长增殖能力降低（主要受阻于G1/G0期），凋亡率增加（P＜0.05），ER-α mRNA和蛋白的相对表达量降低（P＜0.05），但DZA处理前后ER-α基因启动子甲基化状态不发生明显改变。结论 SAH升高抑制HUVEC的增殖能力与ER-α的表达变化有关，但这种作用不是通过改变ER-α基因启动子的甲基化而实现的。 
【关键词】  S-腺苷同型半胱氨酸　人脐静脉内皮细胞　雌激素受体-α　甲基化
    Abstract：Objective To explore the relationship of inhibited proliferative ability induced by intracellular S-adenosylhomocysteine(SAH)accumulation and expression of estrogen receptor-α(ER-α)in HUVEC.Methods After isolated primary HUVEC treated without(normal)or with 3-deazaadenosine(DZA),a potent S-adenosylhomocysteine hydrolase inhibitor,for 24-72h,intracellular SAH level was measured with reversed phase high-performance liquid chromatography(RP-HPLC).The proliferative ability of HUVEC was detected with cytometry,flow cytometry and TUNEL methods.The expression of ER-α protein and mRNA was determined with Western blot and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR)techniques,respectively.The promoter methylation of ER-α gene was analyzed with methylation specific PCR(MSP).Results The results showed that the level of intracellular SAH was increased in HUVEC incubated with DZA compared to normal.The proliferative ability of HUVEC were decreased and the apoptotic rate was increased after treatment with DZA(P＜0.05).The relative expression of ER-α mRNA and protein in HUVEC treated with DZA was lower than that of normal(P＜0.05).But there were no obvious changes of ER-α gene promoter methylation in HUVEC before and after treatment with DZA.Conclusions These findings suggested that the inhibited proliferative ability induced by intracellular increased SAH was correlative with ER-α expression in HUVEC.This action was not related with its promoter methylated patterns.
    Key words:S-adenosylhomocysteine;human umbilical vein endothelial cells;estrogen receptor-α;methylation
    随着研究的深入，人们逐渐发现血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）与血管疾病间并不一定存在着必然的因果关系，蛋氨酸的另一中间代谢产物S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）可能是血管疾病的真正致病因素，而Hcy可能只是其中的一个伴随现象［1］。近年来人们研究证实，动脉粥样硬化（artherosclerosis，As）相关基因启动子甲基化的改变，导致其转录失调在As形成过程中拌演着重要的角色［2］。我们先前研究发现3-deazaadenosine（DZA）作为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的强效抑制剂，其应用在降低Hcy的同时，可以升高胞内SAH含量，降低DNA甲基转移酶1的表达，导致整体基因组低甲基化［3］。为了进一步阐明SAH升高促进As形成的机制，本研究探讨了DZA对HUVEC增殖的影响与ER-α基因表达变化及其启动子甲基化的关系。
    1  材料和方法
    1.1  主要试剂
    1640 培养基干粉购于Hyclone公司；特级胎牛血清、Death Detection Kit(POD原位细胞凋亡检测试剂盒)购于医学研究院生物工程研究所；SAH标准品和DZA购自Sigma公司；Cytotoxicity Detection Kit购自(Roche Molecular Biochemicals公司；Cycle TESTTM PLUS DNA试剂盒购自BD Biosciences Pharmingen公司；Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（Cat DV811A）购自宝生物工程（大连）有限公司；GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒（Cat.GMS30005.2）购自上海杰美基因医药科技有限公司；EZ DNA Methylation-Gold Kit(tm) 试剂盒（Cat.D5005）购自ZYMO RESEARCH CORP公司。
    1.2  细胞来源及分组
    取足月妊娠分娩后的新生儿脐带20 cm，1.25 g/L胰蛋白酶消化分离内皮细胞，1640培养基，10%胎牛血清，5％CO2，37℃常规培养传代［4］。考虑SAH不能直接通过哺乳动物的细胞膜，应用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂DZA阻断SAH向Hcy的转化，从而升高胞内SAH的浓度。实验分为以下4组：①对照组；②5 μmol/L DZA处理组；③10 μmol/L DZA处理组；④20 μmol/L DZA处理组。处理时间分别为24、48、72 h，对照组用等体积的灭菌双蒸水代替DZA。经Cytotoxicity Detection Kit检测乳酸脱氢酶（LDH）释放量完全排除了DZA的细胞毒性作用。
    1.3  反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定SAH浓度    提取胞浆蛋白，Bradford法测蛋白含量后，按1∶1体积比加入等量三氯乙酸（100 g/L，含4 mmol/L EDTA·2K)，漩涡振荡混匀，4℃ 13 000 r /min离心10 min。取20 μl上清液上机分析胞浆SAH的浓度（nmol/mg protein）。检测条件：美国Waters公司高效液相色谱仪，Empower色谱工作站，Waters1525 Binary HPLC pump高压泵，7125i进样器，Waters 2966 photodiode array detector紫外检测器；大连依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；柱温40℃；检测波长260 nm；流动相50 mmol/L NaH2PO4(pH=5.5)∶甲醇=9.5∶0.5,流速0.8 ml/min；进样量20 μl。
    1.4  细胞生长曲线绘制
    以5×104个/ml密度接种HUVEC细胞于24孔培养板中，每孔2 ml，分别加不同浓度的DZA干预培养1～4d，每天各取3孔，台盼蓝染色，显微镜下计数非染色的活细胞数，绘制生长曲线，并按如下公式细胞生长抑制率（GI）=（Nc-Nt）/Nc×100%，其中Nc和Nt分别为某一时相点对照组和处理组细胞数。
    1.5  流式细胞仪检测细胞周期相分布
    按照BD Biosciences Pharmingen公司提供的Cycle TESTTM PLUS DNA 试剂盒说明书进行。细胞经处理后送至中山大学免疫教研室用BD FACScan流式仪（Macintosh操作平台，BD CellQuest1.0分析软件）分析细胞周期相分布。
    1.6  TUNEL检测细胞凋亡
    按照Death Detection Kit,POD原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。主要步骤：4%多聚甲醛溶液室温固定HUVEC 30 min，PBS洗片，与阻断剂（0.3%H2O2甲醇溶液）室温孵育30 min，PBS洗片，加通透液（0.1%TritonTMX-100溶于0.1%枸鞣酸钠溶液）在冰浴中孵育2 min，PBS冲洗2次，滴加50 μl的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60 min，PBS冲洗3次，在荧光镜下分析结果并照相。
    1.7  Western blot法检测ER-α蛋白的表达
    按照GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒说明书进行。提取胞浆蛋白，Bradford法测蛋白含量后，取40g总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳并转移至聚偏(二)氟乙烯膜（PVDF），1%BSA的PBST（含5% tween-20的PBS缓冲液）封闭1 h，1∶400稀释ER-α单抗4℃过夜，PBST漂洗10 min×3，1∶40稀释生物素化二抗工作液，室温振摇1 h，PBST漂洗10 min×3，1∶40稀释HRP标记的链酶卵白素三抗工作液，室温振摇1 h，PBST漂洗10 min×3，DAB显色，照相并进行图象分析计算ER-α蛋白的相对表达量（正常组设为100）。
    1.8  qRT-PCR法检测ER-αmRNA的表达
    HUVEC细胞经处理后送至中山大学达安基因有限公司检测ER-α mRNA的表达量。用TRIZol提取总RNA，取4 μl RNA模板做逆转录成cDNA。内参β-actin采用RT-PCR荧光定量，ER-α采用巢式RT-PCR荧光定量。β-actin引物：Forward 5’-GCG CGG CTA CAG CTT CA-3’，Reverse 5’-TCT CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3’，探针序列5’- FAM-CAC CAC GGC CGA GCG GGA-TAMRA -3’；ER-α外引物：Forward 5’-TGC CAG GCT TTG TGG ATT TG-3’，Reverse 5’-GCC GCT GCA TGA CCT CCT-3’，内引物：Forward 5’-TCT CGT CTG GCG CTC CAT-3’，Reverse 5’-CTG GTT CCT GTC CAA GAG CAA-3’，探针序列5’-FAM-CAC CCA GGG AAG CTA CTG TTT GCT CCT AA-TAMRA-3’。所有引物由上海生工合成。ER-αmRNA的相对表达量为ER-α拷贝数与β-actin的拷贝数之比。
    1.9  MSP法检测ER-α基因启动子甲基化
    按照Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（Cat.DV811A）说明书提取DNA，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit(tm) 试剂盒（Catalog Nos. D5005）说明书步骤对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。通过http://www.ucsf.edu/urogene/methprimer设计ER-α甲基化（M）和非甲基化（U）引物，由上海生工合成，其中甲基化引物：Forward 5’- GAA CGA GTT GGA GTT TTT GAA TC-3’，Reverse 5’- CCG ATC TAA CCG TAA ACC TAC G-3’，扩增片段171 bp；非甲基化引物：Forward 5’- GAA TGA GTT GGA GTT TTT GAA TTG T-3’，Reverse 5’- AAA AAC CAA TCT AAC CAT AAA CCT ACA-3’，扩增片段176 bp。该引物对应序列位于ER-α基因启动子的第二CpG岛（457bp-843bp）。扩增条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，59.5℃30 s，70℃ 30 s，40 循环，最后70℃延伸10 min。扩增产物2%凝胶电泳30 min观察并照相。
    1.10  数据处理
    用SPSS10.0软件进行统计学处理，数据用±s表示，采用Student’s ｔ检验独立样本的差异性，least-squares法进行相关性分析，检验的显著性水平设在Ｐ＜0.05.
    2  结果
    2.1  胞内SAH浓度（图1）
    对照组细胞内SAH的浓度为4.32±0.65 nmol/mg protein，培养24,48,72h后，其含量处于一个相对稳定水平。但经DZA处理后，胞内SAH的浓度显著升高（Ｐ＜0.05），DZA的作用浓度越高、作用时间越长，胞内SAH含量增加越明显，提示DZA对胞内SAH浓度的增加效应具有时间和剂量依赖性。

    2.2  HUVEC细胞生长增殖能力（图2）
    从HUVEC细胞的生长曲线反应DZA对血管内皮细胞生长增殖能力的影响。按公式计算结果显示DZA处理24～96 h对HUVEC细胞的生长抑制率为24.1%～69.6%，相关性分析显示SAH浓度与细胞数存在负相关（r=-0.89,Ｐ＜0.001），提示胞内SAH升高能抑制HUVEC细胞生长增殖。
    2.3  细胞周期相分布
    经三种不同浓度的DZA分别处理24,48,72h后，细胞周期相的百分比分布发生不同的变化，其中G1/G0期随着DZA浓度的增加和作用时间的延长，由正常对照的53.46±12.35%上升至58.21±13.24%～86.20±13.57%，S期由正常对照的35.19±8.96%下降至33.18±8.55%～8.10±2.46%，而G2/M期的变化无，提示胞内SAH升高主要使HUVEC细胞周期受阻于G1/G0期（Ｐ＜0.05），而S期减少（Ｐ＜0.05）。
    2.4  HUVEC细胞凋亡结果（图3）
　　
　　利用TUNEL法检测细胞凋亡时，在荧光显微镜下观察到凋亡的细胞呈阳性。本实验中对照组可见少量荧光染色呈阳性的凋亡细胞，20 μmol/L DZA处理24,48,72 h后，荧光染色的强度逐渐增加，特别是作用72 h后荧光强度最强，提示胞内SAH升高能使HUVEC血管内皮细胞产生凋亡。
    2.5  ER-α蛋白表达（图4）
    Western blot法检测ER-α蛋白的表达结果以PVFD膜上染色条带的深浅来判断蛋白表达的高低。实验结果显示，对照组染色条带最深，5,10,20 μmol/L DZA处理24 h后，染色条带强度逐渐减弱（图4A），图片分析结果显示ER-α蛋白的相对表达量（对照组设定为100%）随着DZA浓度的增加而降低（Ｐ＜0.01，图4B），SAH浓度与ER-α蛋白的相对表达量存在负相关（r=-0.92,Ｐ＜0.001），提示胞内SAH升高能抑制促增殖基因ER-α蛋白的表达。
    2.6  ER-α mRNA表达（图5）
    不同浓度的DZA处理72 h后，与对照组相比，HUVEC细胞ER-α mRNA的表达量显著降低，随着DZA浓度的增加，其表达量下降越明显（Ｐ＜0.05），SAH浓度与ER-α mRNA的表达量间也存在负相关（r=-0.88,Ｐ＜0.001），提示胞内SAH的升高能抑制ER-α mRNA的表达。图5  荧光定量PCR检测ER-α mRNA表达（n=3）
    2.7  ER-α基因启动子甲基化（图6）
    甲基化特异的PCR（MSP）引物有两对：一对是针对基因启动子CpG岛未甲基化序列的引物（U），另一对是针对基因启动子CpG岛发生甲基化序列的引物（M），因而两对引物中只有一对引物（U或M）能扩增，其MSP产物电泳结果只有一个亮带。对照组HUVEC细胞ER-α基因启动子第二CpG岛U引物未见扩增产物（176 bp），而M引物的扩增产物在171 bp处有一亮带，表明ER-α基因启动子第二CpG岛处于甲基化状态，经5,10,20 μmol/L DZA处理72 h后，其甲基化状态仍未发生改变，提示DZA并不能改变ER-α基因启动子第二CpG岛甲基化状态。
    3  讨论
    血管内皮细胞损伤是As发生的早期病理特征。以往有研究发现血管内皮细胞功能的损伤，并不总是随着循环系统中总同型半胱氨酸浓度的增加而增加［2，5］。本研究结果显示，应用DZA升高了胞内SAH含量，细胞的生长增殖能力下降24.1%～69.6%（主要受阻于G1/G0期），同时凋亡率增加，SAH浓度与细胞数存在负相关（r=-0.89,Ｐ＜0.001），从而提示SAH升高能抑制血管内皮细胞的生长，SAH在As的形成过程中发挥着重要的作用。
    有关表遗传学中特异基因启动子甲基化导致其表达变化在肿瘤中报道较多，但在As中目前只有对ER-α、ec-sod及p53等少数几个基因的研究［6］，胞内SAH的升高抑制血管内皮细胞增殖是否与增殖基因ER-α启动子的甲基化而导致其表达有关，未见报道。雌激素受体（ER）属于核受体家族，有ER-α和ER-β两个亚型。在心血管疾病中对ER-α的研究较多，而对ER-β的研究较少［7］。Kortelainen ML等［8］用ER的单克隆抗体检测发现绝经前的女性中患有明显As者其表达降低，提示ER基因表达沉默与As形成有明显的相关性。近年来对已患有冠心病女性的随机研究表明雌激素替代疗法（HRT）对绝经后女性没有益处，且这种效应与脂质变化无关，提示可能有其他机制参与。为了探讨该机制，Post WS等［9］采用Southern blot方法研究表明在右心房中年龄相关ER-α基因甲基化增加，在静脉和动脉中能检测到ER-α表达，在As斑块中比正常邻近动脉ER-α基因甲基化明显增加，而在体外培养人动脉内皮细胞ER-α基因甲基化却保持较低。另外，在培养动脉平滑肌细胞（SMC）与As斑块中的SMC有相似的表型，ER-α基因甲基化水平较高（19%～99%），从而提示血管组织中ER-α基因甲基化致其表达失活在As形成和血管系统老化中发挥重要作用［10］。另有研究也发现ER-α基因甲基化与老龄化As呈明显相关性（r=0.36，Ｐ＜0.05）［9］。然而，本实验结果显示，对照组HUVEC细胞ER-α基因处于甲基化状态，其mRNA的表达量相对内参β-actin来说较低，胞内SAH升高对ER-α基因的甲基化状态没有明显的改变，但在转录和翻译水平降低了ER -α表达（r=-0.92,-0.88,Ｐ＜0.001），提示SAH升高对ER-α的调节作用不是通过改变启动子甲基化实现的，是通过何种途径还有待进一步的探讨。
【】
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