ATP结合盒转运体A1基因R219K多态与冠心病的相关性研究

               作者：王玉明　李亚　郑人源　潘克俭 

【摘要】  　　目的 探讨ATP-Binding Cassette Transporter 1（ABCA1）基因R219K多态在汉族人群中的分布及其与冠心病（coronary heart disease，CHD）的关系。方法 采用PCR-RFLP方法，对396例CHD患者和417名正常人ABCA1基因R219K多态位点进行分析。结果 对照组R219K多态K等位基因及KK基因型的频率（0.465、0.228）较CHD组（0.381、0.162）显著为高（P＜0.05）；根据发病年龄分组，早发CHD组K等位基因及KK基因型频率（0.34、0.111）明显低于晚发CHD组（0.419、0.205）和对照组（P＜0.05），而在对照组和晚发CHD组间此频率差异无显著性（P＞0.05）；KK基因型患者血浆甘油三酯（TG）水平较RR基因型显著降低（P＜0.05）；不同基因型患者血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平差异无显著性（P＞0.05）。结论 ABCA1基因R219K多态与CHD存在相关性；KK基因型可能具有对抗动脉粥样硬化的作用，但这种作用不伴有血浆HDL-C水平的改变。

【关键词】  冠心病；ABCA1基因；动脉粥样硬化

    Abstract：Objective To investigate the distribution of R219K polymorphism in ATP-Binding Cassette Transporter 1（ABCA1）gene in Chinese Han population and the association of this polymorphism with coronary heart disease（CHD）.Methods Genotypes were determined by PCR-RFLP method in 417 unrelated healthy controls and 396 CHD patients.Results The frequencies of K allele and KK genotype for controls（0.465、0.228）were significantly higher than those（0.381、0.162）for patients（P＜0.05）.When the patients were divided into two subgroups by onset-age,the frequencies of K allele and KK genotype for early-onset patients（0.34、0.111）were significantly lower than those(0.419、0.205) for late-onset patients and those for controls（P＜0.05）,while there were no such differences between late-onset patients and controls.Patients with RR genotype had a significantly higher plasma concentration of triglycerides（TG）when compared with that of KK genotype（P＜0.05）.No significant differences of plasma high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C）level were observed among patients with different genotypes.Conclusion These data suggest that the R219K polymorphism in ABCA1 gene is correlated with CHD，and the ABCA1 gene KK genotype may has a function against atherosclerosis without detectable change of plasma HDL-C level in Chinese Han population.    Key words:coronary heart disease；ATP-Binding Cassette Transporter 1 gene；atherosclerosis

　   研究表明，血浆中高密度脂蛋白（HDL）水平与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生呈负相关［1］，HDL对抗AS的功能可能与其在胆固醇逆向转运（RCT）中的作用有关［2］。近年来的研究发现，ABCA1基因在胆固醇逆向转运和HDL生成的起始阶段发挥关键的作用［3、4］。人类ABCA1基因定位于9q22～9q31，编码一种跨膜转运蛋白，该蛋白参与调控脂质（胆固醇、磷脂）的细胞流出过程,并通过与载脂蛋白A-1作用促进新生HDL的形成［5］。报道，ABCA1基因突变可导致细胞内脂质流出减少，血浆中HDL-C严重缺乏，从而使早发CHD的风险显著增高［3、4］。此外，某些单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）可通过改变ABCA1基因表达产物的活性或剂量，影响血脂水平或不同基因型个体对CHD的易感性［6］。作者使用PCR-RFLP方法对中国汉族健康人群和CHD患者ABCA1基因R219K多态位点进行了分析，并探讨了该多态与CHD及血脂水平的关系。

    1  对象和方法

    1.1  对象

    1.1.1  正常对照组  无血缘关系的四川汉族健康个体417名，其中男248名、女169名，平均年龄(59.4±7.6)岁，经询问病史、体检、心电图等检查排除心血管疾病史。

    1.1.2  冠心病患者组  四川大学华西心血管科住院部冠心病患者396例，其中，男237例、女159例，平均年龄(60.1±8.8)岁。所有病例均经冠状动脉造影证实为CHD，其冠状动脉至少有一支狭窄度≥50%。

    1.2  方法

    1.2.1  血脂水平的检测

    研究对象均采用禁食12h后取外周血5ml测定血脂水平。TG和TC（总胆固醇）采用氧化酶法测定，HDL-C、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）以及VLDL-C（极低密度脂蛋白胆固醇）用PEG变构酶法测定。

    1.2.2  研究个体DNA的制备

    采集病例与对照外周血5ml，1ml ACD抗凝剂抗凝。盐析法抽提DNA后TE buffer溶解并置于4℃冰箱中备用。

    1.2.3  ABCA1基因多态片段的PCR扩增

    根据基因组序列（Genbank登录号：NM-005502），设计PCR引物，引物序列：正向：5′-AAGTGTCCTGTCATTGTGCC-3′、反向：5′-TCTCCAGTGAGCAAGTCTAC-3′。PCR反应在PTC-200型循环仪中进行，扩增片段长度为404 bp。PCR反应体系：反应总体积30μl，包括0.5μg基因组DNA，Taq聚合酶1U，MgCl2浓度1.5mmol/L，10×buffer 3μl，dNTP各200μmol/L。扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

    1.2.4  PCR产物的酶切消化

    取10μl PCR扩增产物，加入5U限制性内切酶XagI，2μL 10×酶切buffer,并加超纯水至总体积20μl，37℃水浴中保温16h。酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD Gel Doc凝胶分析系统判定基因型。

    1.2.5  统计学处理

    各组基因型及等位基因频率，经χ2检验，确认符合Hardy-Weinberg平衡；组间各等位基因频率和基因型频率比较采用χ2检验；组间不同基因型血脂水平比较用单因素方差分析。数据用SPSS12软件进行分析，以P＜0.05为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  CHD组和对照组临床特点比较

    两组间年龄、性别构成比以及血浆中TC、VLDL-C水平差异无显著性（P＞0.05）；与对照组比较，CHD组TG、LDL-C水平在升高（P＜0.05）的同时，HDL-C水平显著降低（P＜0.01）。

    2.2  基因型鉴定

    R219K多态为ABCA1基因第219位密码子G→A碱基转换，其中，A等位基因存在限制性内切酶XagI的切点，从而导致3种基因型的出现：RR型图1  R219K多态位点的RFLP-PCR电泳结果

    1：KK纯合子；2、3：RR纯合子；4、5、6：RK杂合子；M：DNA分子量标准(puc19/MspI)

    Fig.1 Electrophoresis result of PCR-RFLP analysis of R219K polymorphism

    Lane 1:KK homozygote:lane 2、3：RR homozygote;Lane 4、5、6:RK heterozygote;M:DNA marker(puc19/MspI)（GG型、无酶切位点的纯合子），酶切后长度仍为404bp；KK型（AA型、存在酶切位点的纯合子），酶切产物为310 bp和94bp两个片段；RK型 (GA型、3种片段的杂合子)，酶消化后显示大小分别为404bp、310 bp、94 bp的3个片段（图1）。

    2.3  CHD组与对照组间基因型和等位基因频率的比较（表1）    R219K多态各基因型在两组中分布符合遗传Hardy-Weinberg平衡。经χ2检验，等位基因R、K频率在两组间分布差异有显著性，对照组K等位基因频率显著高于CHD组（P＜0.01）；对照组KK基因型频率显著高于CHD组（P＜0.05）；CHD与K等位基因负关联［OR=0.708，95%CI(0.581,0.863)］；与基因型KK负关联［OR=0.653，95%CI（0.459，0.929）］。

    2.4  CHD分组后基因型和基因频率分布比较（表2）表1  ABCA1基因R219K 的基因型及等位基因频率在对照组和CHD组中的分布照组比较，P＜0.01）；OR：odds ratio（比值比）。

    参照有关CHD发病年龄分类标准［7］，将CHD组分为早发CHD组（男性≤55岁，女性≤60岁）和晚发CHD组（男性年龄＞55岁，女性＞60岁）， 并对两个亚组基因及基因型频率分布进行分析（表3）。早发CHD组K等位基因及KK基因型频率在明显低于对照组的同时（P＜0.01)，也低于晚发CHD组（P＜0.05)；而在对照组和晚发CHD组间两者差异均无显著性（P＞0.05）。表2  R219K基因型和等位基因在早发CHD组和晚发CHD组中的频率分布CHD组比较，△P＜0.05）。

    2.5  不同基因型患者间血脂水平的比较（表3）

    方差分析结果表明，RR基因型的患者血浆TG水平在明显高于KK基因型患者（P＜0.05）的同时，也有高于RK基因型患者的倾向。 表3  不同基因型患者血脂水平比较 * P＜0.05;血脂指标浓度单位均为mmol/L(units of plasma lipid levels are denoted by mmol/L)

    3  讨论

    R219K多态为ABCA1基因第219密码子G→A转换，导致Arg→Lys氨基酸替代。我们首次报道K等位基因频率在汉族群体为0.465，较德国人频率（0.26）、芬兰人（0.22）［6］显著增高。另外，Yamakawa［6］等在327名中学生群体筛查的结论支持K等位基因在日本人群中可能为野生型，高于上述报道的频率。说明R219K多态的变异频率在不同的种族间存在差异性。

    Clee［8］等在对荷兰CHD患者的研究中发现，K等位基因能减少冠状动脉再狭窄、心肌梗塞、死亡等并发症的发生率，并能减缓AS的进程，提出K等位基因对于减少冠心病的发生具有保护作用。我们采用病例—对照研究，分析了中国汉族健康人群和CHD患者R219K多态性。结果显示，对照组K等位基因及KK基因型频率均显著高于CHD组。表明该多态可能与中国人CHD存在相关性，并提示纯合状态下的K等位基因（KK基因型）可能是拮抗AS的保护因子，与Clee等报道略有不同。

    在此基础上，作者根据CHD患者发病年龄进行分组，结果可见早发CHD组K等位基因和KK基因型频率均较晚发CHD组降低，而上述基因和基因型频率在对照组和晚发CHD组间差异无显著性，提示KK基因型和CHD发病年龄相关，对于CHD的发生，KK基因型年轻个体较RR、RK基因型年轻个体可能具有更低的易感性，更易于晚发CHD。因而也从另一角度提示KK基因型可能对减少冠心病的发生具有保护作用。

    值得注意的是，未见不同基因型患者间血浆HDL-C水平有显著差异。Zwarts［9］等在对该基因其它多态研究中也得出类似结论，并认为 K等位基因对抗AS的作用并非表现为血浆HDL-C浓度升高。转基因动物模型研究［10］发现，ABCA1基因的过度表达，导致小鼠巨噬细胞内胆固醇流出的增加，但血浆中HDL-C浓度变化甚微。提示，RCT速度的加快，可能更多的是增加外周细胞胆固醇转运至肝脏的数量，并非一定反映在血浆HDL-C浓度的改变上。此外，研究亦表明，血浆HDL-C水平是多个候选基因及其环境因素相互作用的结果［11］，单个基因多态对HDL-C水平的影响是微效的。因此,作者认为:KK基因型的作用机理可能在于增强ABCA1的活性，从而加快胆固醇从外周细胞流向肝脏的速度，有效的清除机体细胞内多余的胆固醇，从而限制AS的发生。

【】
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