雌激素对正常人精子受精能力的影响及其机制初探

                    作者：何彦芳　岳利民　郑洁　何亚平　张金虎

【摘要】  　　目的 研究雌激素物质17β-雌二醇（E2）对正常生育男性体外受精能力的影响，并初步探讨其可能的机制。方法 精子悬液中分别加入不同浓度的E2及非透膜性交联物雌二醇-牛血清白蛋白（E2-BSA），获能4h后行体外受精，观察卵子受精率（FR）和受精指数（FI）的变化；进一步去除培养液中钙离子（Ca2+），再次观察无钙环境下E2对人精子FR和FI的影响。结果 一定浓度的E2（1μmol/L、10μmol/L）可显著提高人精子的FR和FI（P＜0.05），较低和较高浓度的E2（0.1μmol/L、100μmol/L）则对人精子FR和FI无显著影响（P＞0.05）；另外，非透膜性大分子物质E2-BSA（2mg/L)也可明显提高人精子的FR和FI（P＜0.05）。去除获能液中的Ca2+后，E2对人精子FR和FI无显著影响（P＞0.05）。结论 培养液中加入一定浓度的E2可提高人精子的体外受精率，其作用机制可能是通过与精子膜上的雌激素受体或雌激素结合位点相互作用后促进胞外Ca2+内流而实现的。

【关键词】  17β-雌二醇；雌二醇-牛血清白蛋白；人精子；受精;仓鼠卵穿透

    Abstract：Objective To study the effect and possible mechanism of 17β-esrtrodial(E2) on the fertilizing ability of human spermatozoa in vitro.Methods Spermatozoa were exposed to E2 at different concentrations and the membrane impermeable conjugated 17β-estradiol(E2-BSA) respectively.After incubated in capacitating medium for 4 hours and in vitro fertilization for 3 hours,fertilization rate(FR)and fertilization index(FI)were assessed.Furthermore, spermatozoa were exposed to E2 in calcium-free capacitating medium to assess the FR and FI again.Results E2 at concentration of 1μmol/L and 10μmol/L significantly enhanced the FR and FI(P＜0.05). However,E2 at lower or higher concentration(0.1μmol/L or 100μmol/L)had no significant effect on the FR and FI(P＞0.05).Besides,E2-BSA(2mg/L) also enhanced fertilizing ability of human spermatozoa(P＜0.05).E2 had no significant effect on the FR and FI in calcium-free capacitating medium(P＞0.05).Conclusion The results indicated that E2 at suitable concentration could affect the fertilizing ability of human spermatozoa in vitro,which may mediate by binding with the site or estrogen-receptor on human spermatozoa membrane to cause the influx of extracellular calcium.

    Key words:estrogen;E2-BSA;human spermatozoa;fertilization;hamster egg penetration

     精液和雌性生殖道内存在丰富的雌激素，排卵前的卵泡液中雌激素的浓度尤为高（大约12.5 ng/ml～4 100 ng/ml）［1］。人精子在穿越女性生殖道的过程中，雌激素可能会与精子相互作用，从而影响精子的运动、获能、受精等各种功能。有研究发现，人精子膜上存在雌激素的特异性结合位点或雌激素受体［2］，因此，雌激素可能通过与精子膜上的这种结合位点或雌激素受体相互作用来影响精子功能。目前认为，雌激素可以增强人精子的顶体反应过程，促进精子的前向运动力，但是雌激素对人精子在体内或体外受精能力的影响和机制目前还不清楚。17β-雌二醇（E2）是活性比较高的雌激素物质，本实验用E2以及E2与牛血清白蛋白交联而成的非透膜性大分子（E2-BSA）分别作用于生育力正常男性的获能精子，以初步探讨雌激素对人精子在体外穿卵试验的作用及其可能机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要试剂  17β-雌二醇（E2）、雌二醇-牛血清白蛋白复合物（E2-BSA）均购自Sigma公司；孕马血清促性腺激素（PMSG）购自天津生物制品研究所；人绒毛膜促性腺激素(hCG)购自上海生化制药厂；透明质酸酶、胰酶为Sigma公司产品；人血清白蛋白（HSA）购自成都蓉生药业有限责任公司。

    1.1.2  实验动物  穿卵实验所用金黄地鼠购兰州生物制品研究所。

    1.2  方法

    1.2.1  标本来源和精液处理  实验所用精液标本由年龄24～43岁、生育力正常、身体健康的成年男性提供。其精液常规各指标符合WHO规定的精液常规标准［3］，即精子密度大于或等于20×109／L，活动率大于或等于70％，活动良好，白细胞少于1×109／L，pH 7.2～7.8，体积大于或等于2 ml，精浆及血清抗精子抗体阴性。供精者禁欲3～7 d，手淫获取全份新鲜精液标本，于37℃，5％CO2孵箱中放置30～60 min，完全液化后以上游法获取高活力精子。

    1.2.2  实验步骤和分组  取13例精液标本的上游精子，500g离心、BWW低蛋白液（含0.3％HSA）洗涤3次后用BWW获能液（含3.5％HSA）重悬，并调整密度至2×1010/L。将每例标本的精子悬液均分为六组，一组为空白对照组，另外五组为处理组。在处理组精子悬液中分别加入终浓度分别为0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L的E2和2 mg/L的E2-BSA，对照组加入不含处理因素的等量获能液于相同条件下培养，各组精子在37℃，5％CO2孵箱中培养4 h使之完全获能，之后进行体外受精。

    另取10例精子标本的上游精子均分为含钙组和无钙组，分别用含钙的BWW获能液和无钙的BWW获能液重悬，调整精子密度至2×1010/L，之后两组精子悬液又各分为两小组，一小组为空白对照，另一小组加入终浓度为10 μmol/L的E2，各小组精子均在孵箱中完全获能4h后行体外受精。

    1.2.3  人精子穿透去透明带金黄地鼠卵异种体外受精试验（SPA）  取8～12周龄雌性金黄地鼠，于实验前3 d腹腔注射PMSG，58 h后再注射HCG（40IU/只），18 h后断颈处死，无菌条件下取出输卵管，在解剖显微镜下挑出卵块，分别用0.1％的透明质酸酶和0.1％胰酶去掉颗粒细胞及透明带。将30～40个去透明带卵子加入到获能后精子悬液中，在37℃，5％CO2孵箱中行体外受精3 h。随后将受精后的卵细胞在培养液中洗涤3次，然后低渗﹑固定，用Giemsa染色，根据卵内是否具有膨大的精子头作为判断受精的标准(如图1)，根据总卵数及受精卵数穿卵率（FR，被精子穿透的卵细胞数与卵细胞总数的比值）和受精指数（FI，穿入卵细胞内的精子总数与卵细胞总数的比值）。

    1.3  统计学处理

    实验所得数据均±ｓ以表示，采用SPSS 10.0统计软件对数据进行ｘ2检验，以P＜0.05为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  E2和非透膜性大分子物质E2-BSA对人精子SPA试验的作用表1  E2和E2-BSA对人精子穿卵率和受精指数的影响表1所示为不同浓度E2和大分子物质E2-BSA作用后人精子SPA试验的FR和FI的变化。统计结果显示：与空白对照组相比，1 μmol/L E2和10 μmol/L E2作用组精子SPA试验的FR和FI均明显提高(P＜0.05)，两作用组之间FR和FI无显著差异(P＞0.05)；100 μmol/L E2作用组的FR和FI无显著变化(P＞0.05)；同时，2 mg/L E2-BSA（相当于游离E2 10 μmol/L）作用组的FR和FI也显著提高(P＜0.05)，并且其作用与E2（10 μmol/L）相比无显著差异(P＞0.05)。

    2.2  无钙液处理时E2对人精子SPA试验的作用

    表2所示为含钙组和无钙组精子分别用10 μmol/L E2处理后SPA试验的FR和FI的变化。统计结果显示：在含钙组，E2作用后精子SPA试验的FR和FI均显著提高(P＜0.05)；在无钙组，与空白对照相比，E2作用后精子SPA试验的FR和FI均无显著变化(P＞0.05)；同时，E2作用后，无钙组的FR和FI显著低于含钙组(P＜0.05)，含钙空白对照组的FR和FI显著高于无钙空白对照组(P＜0.05)。 表2  无钙环境下E2对人精子FR和FI的影响

    3  讨论

    精子穿透去透明带金色仓鼠卵试验（SPA）是测定精子获能、顶体反应和精卵相互激活能力的一种经典方法，是对精子最终获能结果的观察，该方法能客观地反映精子的受精能力。现已发现，雌激素可促进精子获能，提高其前向运动力，并且增强精子顶体酶的活性，促进顶体反应的发生［4-5］，精子获能和最后发生顶体反应是精子获取受精能力必备的条件。

    Adeoya-Osiguwa等报道，17β-雌二醇能够提高小鼠顶精子顶体反应率和SPA试验的卵细胞受精率［6］。在本实验中，将1 μmol/L及10 μmol/L的E2作用于生育力正常男性获能精子4h后，发现精子SPA试验的FR和FI均显著提高，这进一步为上述雌激素对精子功能的促进作用提供了证据。但是，0.1 μmol/L和100 μmol/L E2对人精子FR和FI无明显影响，这表明，过高或过低浓度的雌激素对精子的活能和顶体反应过程没有诱导或具有抑制作用。1 μmol/L、10 μmol/L的E2接近卵泡液中的雌激素浓度，这说明在接近生理条件下的雌激素浓度对精子获能和顶体反应诱导作用最大。另外我们还发现，在2 mgl/L的E2-BSA作用下，精子SPA试验的FR和FI的也明显提高，并且其作用与10 μmol/L游离的E2相似。E2-BSA是由雌二醇与牛血清白蛋白交联而成的一种大分子物质，其中不含游离状态的E2［7］，这种大分子物质是不能穿过精子细胞膜的。E2-BSA可使人精子受精能力增强这一结果表明，雌激素的作用位点应该在精子膜上。就成熟的人精子而言，其染色质高度凝聚，蛋白合成水平极低，并且缺少胞浆及核内的雌激素受体［8］，因此，雌激素对精子功能的影响可能是通过快速的非基因组的作用方式来实现的。Baldi等人认为，人精子膜上存在有限的雌激素的受体或雌激素结合位点，这与本实验中观察到的精子SPA试验的FR和FI并不随雌激素浓度的增大而增大的结果是一致的。

    Ca2+是体细胞和生殖细胞实现其生物功能必不可少的因素，精子的获能和顶体反应以及受精的完成与精子胞内游离Ca2+浓度的升高密切相关［9］。本实验中，我们进一步去除培养液中的Ca2+之后，再用E2作用人精子，结果发现，精子SPA试验的FR和FI无显著变化。资料表明，雌激素诱导获能和顶体反应的作用是通过促进胞外Ca2+内流而实现的［10］。精子胞内游离Ca2+浓度升高后可激活腺苷酸环化酶或者抑制磷酸二酯酶，进一步引起精子内cAMP水平升高，从而启动精子的超激活运动［11］。超激活运动对于精子穿越输卵管，最后穿过卵丘细胞及其胞外基质和透明带起着重要的作用。结合以往的研究和本实验的结果，我们分析，雌激素提高正常男性精子穿卵试验FR和F1的原因可能是通过引起环境中Ca2+内流继而激发精子的超激活运动而实现的。

    综上所述，一定剂量的雌激素能够提高人精子的体外受精能力，这种作用可能是通过雌激素与精子膜上的雌激素受体或结合位点相互作用，继而引起胞内Ca2+内流而实现的。同时，我们的研究结果也许可以为将来临床上运用雌激素处理人精子以提高体外受精率提供一定的实验依据。

【文献】
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