IL-18-PE38真核表达质粒的构建及表达

                作者：代吕霞，李 虹，陈登榜，曾俊   

【关键词】  免疫毒素

    基因重组免疫毒素是通过基因工程技术将具有导向能力的分子(载体)和具有细胞毒性的分子(毒素)偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子。它具有分子小，产品均一性高，活性高，异源性低，易于大规模制备等优点，是研究免疫毒素进程中的一大飞跃。在肿瘤，异体移植排斥，自身免疫疾病及慢性感染性疾病等方面表现出巨大的潜力。迄今为止，已有一系列重组免疫毒素在体外实验和动物实验中显示出良好的效果［1～4］。本实验首先通过RT-PCR获得了mIL-18基因片段，然后将具有导向作用的IL18和具有细胞杀伤作用的PE38的基因构建成IL18-PE38融合基因真核表达载体，并将其转染到NIH3T3细胞，观察其目的蛋白的表达情况，为进一步研究IL18-PE38重组免疫毒素对自身免疫性疾病基因治疗的作用奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  载体和细胞株含有PE38基因的载体PRKL459K为本室保存。真核表达载体Psec Tag 2B为invitrogen公司产品。感受态菌JM109为Takara公司产品。NIH3T3细胞为本校细胞生物教研室提供。

    1.2  试剂RT-PCR试剂盒为Takara公司产品。Trizol Reagent为GibicoBRL公司产品。限制性内切酶、T4DNA连接酶为New England公司产品，DNAmarker为Promega公司产品。凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品。DMEM培养基为invitrogen 公司产品。脂质体为Qiagen公司产品。新生小牛血清为成都哈里公司。抗IL-18多克隆抗体(C-18):sc-6177为Santa CrusBiotechnology公司产品。FITC标记兔抗山羊IgG、封闭用羊血清原液均为北京中山公司产品。

    1.3  IL-18cDNA的制备用Trizol一步法提取小鼠肝总RNA，然后用RT-PCR试剂盒进行逆转录及扩增。PCR引物，上游为：5'-GGAATTCCATATGAACTTTGGCCGACTTCAC-

    TGTAC-3'(含Nde1酶切位点)；下游为:5'-CCCAAGCTTACTTTGATGTAAGTT-AGTGAGAGTGAA-3'(含HindIII酶切位点)，反应体积为50μl，反应参数为：逆转录为42℃ 45min；PCR为94℃ 3 min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30个循环后72℃延伸10 min。扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

    1.4  Psec Tag2B-IL-18-PE38真核表达载体构建及鉴定    回收纯化RT-PCR产物后经Nde1和HindIII双酶切，回收纯化；HindIII和EcoRI双酶切质粒PRKL459K-PE38和载体Psec Tag2B，同样电泳回收纯化，T4连接酶作用下16℃连接过夜，产物转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单克隆于3 ml LB培养基中37℃培养过夜，小量提取质粒DNA，分别用PCR和酶切反应进行鉴定，将阳性克隆菌株进行序列测定。

    1.5  细胞转染取冻存的NIH3T3细胞复苏，次日更换培养液。当细胞生长达50％～80％瓶底面积时，用0.25％胰酶消化细胞，调整细胞浓度，以5×106/孔接种6孔板，当细胞生长达70％瓶底面积后，用Psec Tag2B-IL-18-PE38重组质粒进行转染，以Psec Tag2B空质粒作为对照，转染试剂为脂质体，具体方法参照说明书和《分子克隆》进行。转染24 h后换新鲜10%小牛血清DMEM培养基2 ml，继续培养。

    1.6  荧光免疫化学法测定表达情况转染后48 h，将细胞爬片用PBS洗涤2次，用免疫荧光法检测目的蛋白的表达情况，其主要步骤如下：4%多聚甲醛室温固定，滴加封闭血清，室温孵育30 min，滴加IL-18抗体(1∶500)20μl，4℃过夜，PBS洗3次，每次2 min，滴加荧光标记二抗(1∶100)20 μl，37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次2 min，然后50%甘油封片，荧光显微镜观察结果并照片。

    2  结果

    2.1  IL-18cDNA的获得通过RT-PCR得到一条大小约480 bp的单一特异性条带，与预期的mIL-18片段大小相符(见图1)。

    图1  RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

    Fig.1  Electrophoretic analysis of RT-PCR product

    1.DNA marker；2.RT-PCR product

    2.2  Psec Tag2B-IL-18-PE38真核表达载体鉴定

    分别将重组质粒Psec Tag2B-IL-18-PE38和Psec Tag 2B空质粒进行EcoRI单酶切，结果经电泳鉴定显示为一条分子量约6 200 bp的DNA片段和一条分子量约4 500 bp的DNA片段，与预期值相符（IL-18大小为480 bp，PE38大小为1 150 bp），表明IL-18-PE38已成功插入到Psec Tag 2B质粒中。重组质粒用IL-18引物进行PCR扩增后通过琼脂糖凝胶电泳显示片段大小为480 bp左右，与IL-18片段大小相符(见图2)。测序结果显示重组质粒中的IL-18-PE38基因片段（包括两端的酶切位点），其编码序列与Gen Bank登录的小鼠IL-18与PE38cDNA序列相符，且IL-18与PE38基因连接正确，阅读框架不变。

    2.3  荧光免疫化学法鉴定转染结果重组质粒转染NIH3T3 48 h后，取细胞爬片进行免疫荧光实验，结果显示实验组细胞有明显荧光表达且荧光强度在细胞膜上分布更明显，对照组细胞未见明显荧光表达(见图3)。

    3  讨论

     PE 38是绿脓杆菌外毒素A(PEA)的衍生物，是缺失了Ia区和部分Ib区，分子量为38 KD的片段［5］。由于去除了PE的细胞结合部位(Ia区)，使PE 38丧失了非特异性细胞结合能力，但仍保留了转位能力和细胞毒活性；由于分子量的减小，降低了PE38的免疫原性，减小了对正常组织的损害，增强了融合蛋白的运输和在局部的扩散，因而在目前重组免疫毒素的构建中被广为采用。ChayB,Siegall等人对PE 38细胞毒性和ADP核糖基化功能进行了分析，证明PE 38依然能有效催化ADP核糖基化，阻滞EF-2在胞浆内促进肽链延长，导致细胞凋亡。白细胞介素18又称γ-干扰素诱导因子（interferon-gamma inducing factor imI GIF）,是由活化的单核巨噬细胞产生的一种细胞因子。目前已知在免疫应答过程中，活化的T细胞将表达多种细胞因子如IL-2、IL-12、IL-18的受体以及多种趋化因子受体如CCR-5、CXCR-3等。在这些膜受体中，现已证实IL-18受体(IL-18R)选择性的表达于活化的Th1细胞，而Th2细胞没有表达［6］，并且它的表达是稳定的、持久的，故表达IL-18R可成为IL-18免疫毒素的一个靶子，从而介导IL-18免疫毒素有效地杀伤活化的Th1细胞。大量实验已证实，Th1细胞及其分泌的细胞因子主要参与器官特异性自身免疫性疾病，如I型糖尿病(IDDM)，多发性硬化(MS)，类风湿性关节炎(RA)等［7］。实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimeatal allergic encephalomyelitis,EAE)是由T细胞介导的中枢神经系统自身免疫性疾病，是器官特异性自身免疫性疾病的典型代表，也是MS理想的动物模型［8］。所以本实验所构建的重组免疫毒素IL-18-PE38，是以IL-18为导向分子，毒素PE38攻击杀灭高表达IL-18R的Th1细胞，诱导特异的自身免疫耐受，从而达到防治相关自身免疫性疾病的目的。小鼠IL-18cDNA全长约1.1 Kbp，编码192个aa的无活性的前体，分子量约为18.3 KD，包含由35个aa组成的特殊的引导序列，但缺乏传统的信号序列［9-10］。为了保证IL-18产物具有生物学活性，我们在设计PCR引物时去掉了mIL-18的引导序列，同时也去掉了其cDNA的3′端非编码区。PSec Tag2B是一种真核表达质粒，它携带的小鼠Ig-kappa chain V-J2-C的分泌信号，有利于不带自身分泌片段的外源蛋白的表达；同时还可以给外源蛋白羧基端加上c-myc和6个组氨酸的标记，便于表达蛋白的检测和纯化，因而是本研究中较为理想的一种真核表达载体［11］。本实验通过RT-PCR获得了小鼠IL-18cDNA，运用分子克隆技术，成功构建了重组的真核表达载体Psec Tag2B-IL-18-PE38，经转染体外细胞株后获得了有效表达，这为下一步自身免疫性疾病动物模型的基因治疗打下了基础。

【】
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