白藜芦醇体外抑制人胰腺癌细胞增殖的实验研究
【摘要】 目的:探讨白藜芦醇(resveratrol，Res)体外对胰腺癌MIAPaCa-2细胞增殖的影响，并探讨其初步机制。方法:采用四甲基氮唑蓝法（MTT）检测Res处理后MIAPaCa-2细胞的增殖情况。用倒置显微镜、透射电镜观察Res处理后细胞形态学改变，用流式细胞仪分析经25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1 Res分别作用48 h后MIAPaCa-2细胞凋亡率。结果:Res体外能明显抑制MIAPaCa-2细胞的生长增殖，且在一定范围内呈时间、浓度依赖性。经Res处理后，倒置显微镜观察到细胞数目减少，部分细胞变圆，核浓缩，提示可能存在细胞凋亡；电镜证实存在典型的细胞凋亡形态学改变。用25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1 Res处理48 h后，流式细胞仪检测出各处理组的细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。结论:Res在体外能明显抑制MIAPaCa-2细胞的增殖，诱导细胞调亡可能是Res抑制MIAPaCa-2细胞增殖的主要机制之一。
【关键词】 白藜芦醇 胰腺癌 增殖 凋亡
Abstract: Objective:To explore the effect of resveratrol(Res) on the proliferation of pancreatic carcinoma MIAPaCa-2 cells in vitro and explore the rudimental mechanism. Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium method (MTT) was used to detect the cell growth status of MIAPaCa-2 cells after treatment with Res. The morphologic changes of cells after treatment with Res were detected by inverted microscope and transmission electron microscope. The apoptosis rates were analyzed with flowcytometry(FCM) after the cells were treated with 25μmol·L-1, 50μmol·L-1, 100μmol·L-1 and 200μmol·L-1 Res for 48 h, respectively. Results: Res inhibited the proliferation of MIAPaCa-2 cells in a concentration-and time-dependent manner as measured by MTT method. After the cells were treated with Res, inverted microscope observed the reduction of the cell number and found significant morphologic changes, characterized by cell rounding and cell nuclear enrichment suggesting apoptosis. And the presence of typical morphological changes of apoptosis was confirmed with transmission electron microscope. The apoptosis rates at 25μmol·L-1, 50μmol·L-1, 100μmol·L-1 and 200μmol·L-1 Res-treated groups after treatment for 48 h, measured by FCM, were significantly higher than those in control groups(P<0.05). Conclusion: These findings suggest that the natural product Res may have a potent anti-proliferative effect on MIAPaCa-2 cells,the mechanisms of which may be related to the induction of apoptosis.
Key words: resveratrol; pancreatic carcinoma；proliferation；apoptosis
胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道肿瘤, 在美国居癌症死因的第4位[1]，在我国其发病率也有上升趋势。胰腺癌由于早期临床表现隐匿，相当部分病人就诊时已属晚期，手术根治性切除率只有25%左右[2]，所以多数病人只能采用化疗、放疗等姑息性手段，然而现有化疗药物,即使包括吉西他滨在内，对胰腺癌的治疗效果均欠佳。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种多酚类化合物，在我国中药植物虎杖鲜根中有较高的含量[3]，近年研究发现Res对胃癌、乳腺癌等具有显著体外增殖抑制作用[4，5]，因此，Res有望成为治疗肿瘤的新药。目前关于Res和胰腺癌治疗方面的研究甚少，因此我们选择Res和胰腺癌MIAPaCa-2细胞为研究对象，通过体外实验观察Res对胰腺癌细胞增殖的影响，来初步探讨Res用于胰腺癌治疗的可能性。
1 材料和方法
1.1 细胞株与试剂 人胰腺癌MIAPaCa-2细胞株购自湖南远泰生物公司。Res购自美国Sigma公司，纯度>99.9%，用二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)溶解，配成 400μmol·L-1贮存液，消毒后，分装，于-20 ℃冻存备用。噻唑蓝(MTT)和 DMSO均为美国Amresco公司产品，处理细胞时，DMSO浓度≤0.1%(实验证实该浓度对细胞生长无影响)。DMEM培养基(Dulbecco modified Eagle medium)、0.25%胰酶为美国GIBCO公司产品，碘化丙啶(propidium iodine，PI)为美国Sigma公司产品。
1.2 细胞培养 人胰腺癌MIAPaCa-2细胞在 5%CO2，37 ℃条件下，用含10%小牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U·ml-1青霉素、100μg·ml-1链霉素的DMEM培养液传代培养，培养至70%～80%融合时，用0.25%胰酶消化传代继续培养。
1.3 MTT法检测Res处理后MIAPaCa-2细胞的增殖抑制率 胰腺癌MIAPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105/ml，重新接种到96孔培养板上，约1×104/孔，于37 ℃过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。然后，将细胞分Res处理组、溶剂对照组及空白对照组：Res组分别换用含不同浓度Res(25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1)的培养液100μl；溶剂对照组换用100μl含与Res相应浓度DMSO的培养液；含100μl培养液(不含细胞与药物)孔板作为空白对照组。每组设3复孔。分别培养12 h、24 h、48 h、72 h后，加入MTT(5 mg·ml-1)20μl/孔，继续培养4 h后，去上清，加入DMSO 100μl/孔，室温振荡10 min，上酶标免疫测定仪检测，492 nm波长测定吸光度值(absorbance，A)。比色时，空白组调零。细胞增殖抑制率，抑制率=(1-处理组A/溶剂对照组A)×100%。绘制不同时间浓度-抑制率曲线。以上实验重复3次。
1.4 形态学观察
1.4.1 倒置光学显微镜观察：胰腺癌MIAPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105/ml，重新接种到96孔培养板上，为1×104/孔，于37 ℃过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。将细胞分Res组和对照组：Res组分别换用含不同浓度Res(25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1)的培养液100μl，对照组含不加药物培养液100μl。于5%CO2、37 ℃条件下分别继续培养48 hr后，倒置光学显微镜观察细胞形态学改变并摄片。
1.4.2 透射电镜观察：胰腺癌MIAPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化后，接种到6孔培养板上，于37 ℃过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。将细胞分Res组和对照组：Res组换用含25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1 Res的培养液，对照组含不加药物培养液。5%CO2、37 ℃条件下分别继续培养48 h后，分别收集对照组、Res处理组的细胞，送湘雅医学院电镜中心检测。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 胰腺癌MIAPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化后，重新接种到6孔培养板上，于37 ℃过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。将细胞分Res组和对照组：Res组换用含不同浓度Res(25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1)的培养液，对照组含不加药物培养液。5%CO2、37 ℃条件下分别继续培养48 h后，收集对照组、25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1 Res处理组细胞(≥1×106)，加预冷70%乙醇固定过夜，用PI染色。流式细胞仪检测，multicycle软件分析结果。
1.6 统计学处理方法 单处理因素组间多样本均数的多重比较采用单因素方差分析,并用LSD-t检验进行样本均数间两两比较；多处理因素采用析因设计的方差分析，并用单因素方差分析和LSD-t检验进行样本均数间两两比较，用SPSS10.0软件分析结果。
2 结果
2.1 MTT比色法检测细胞增殖抑制率 分别用25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1处理MIAPaCa-2细胞12 h、24 h、48 h、72 h后，酶标仪测定A值结果后,增殖抑制率，具体结果见图1。用两因素析因设计方差分析后，结果显示：①不同浓度Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞增殖抑制率不同(F=526.12，P=0.000)；②Res不同作用时间对胰腺癌细胞增殖抑制率不同(F=805.27，P=0.000)。并用单因素方差分析和LSD-t检验进行样本均数间两两比较，结果分析示：除 100μmol·L-1与200μmol·L-1分别处理12 h或72 h抑制率差别无统计学意义外，其余各组在同一时间或同一浓度范围内，组间两两差异均有统计学意义(P<0.05)。可见Res体外对MIAPaCa-2细胞有明显抑制作用,且在一定范围内基本上呈浓度、时间依赖性。
2.2 形态学观察
2.2.1 倒置光学显微镜：对照组细胞贴壁生长良好，细胞充分生长，透光度好。25μmol·L-1 Res外理MIAPaCa-2 细胞48 h后，倒置显微镜观察见极少量细胞变圆，核浓缩，随着药物作用浓度的增加，核浓缩细胞数量增多，细胞间隙增大，细胞数目减少，提示可能存在细胞凋亡，详见图2。
2.2.2 透射电镜观察：对照组细胞核大，圆形或椭圆形，形态较规则，染色质分布均匀,胞浆内有丰富的细胞器(见图3A)。25μmol·L-1 Res处理48 h后，电镜下见少数细胞出现细胞体积缩小，内容物浓缩，核体积变小，染色质聚集变粗，成块靠边，细胞器浓缩，细胞表面有突起，但细胞膜尚完整(见图3B)；随着药物浓度增大,电镜示细胞染色质更加密集，核碎裂增多及大量典型凋亡小体产生(见图3C、图3D)。结果见图3。
2.3 流式细胞仪检测凋亡率 结果示对照组细胞凋亡率为(2.40±0.50)%，25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1 Res处理48 h后细胞凋亡率分别为(4.60±1.25)%，(12.77±0.825)%，(23.40±2.50)%，(25.40±2.46)%，详见表1。各组均数比较的单因素方差分析得F=107.50，P=0.000，用LSD-t检验进行样本均数间两两比较示各处理组与对照组之间差异具有显著性(P<0.05)，25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1 Res处理组凋亡率两两差异皆有显著性(P<0.05)，而100μmol·L-1与200μmol·L-1 Res处理组之间凋亡率差异无统计学意义。
3 讨论
3.1 Res的分子结构及生物学作用 Res的化学名为芪三酚(3，5，4'-trihydroxystibene)，分子式是C14H12O3，相对分子量为228.25，属于非黄酮类多酚化合物，于1940年首次从毛叶藜芦(veratrumgrandiflorum)的根部分离获得。近年来的研究发现，Res广泛存在多种植物中，以中药植物虎杖中含量较为丰富。研究还证实，Res对人体具有调节脂类代谢、防止低密度脂蛋白氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、保护心脑血管和抗炎、抗过敏与抗肿瘤等多种药理作用[6]；而且，Res为天然化合物,无毒副作用,故其药用价值极大，已引起了全世界科研人员的高度关注。本研究通过观察Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞体外增殖的影响并探讨其初步机制,旨在进一步认识该药的药理作用，为进一步利用开发该类药物提供实验依据。
3.2 Res对MIAPaCa-2细胞的增殖的影响 肿瘤对药物敏感的实验分为体内实验和体外实验两种，体外实验是体内实验的基础。本实验通过MTT法检测到Res对MIAPaCa-2细胞有显著增殖抑制作用，25μmol·L-1 Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞增殖抑制作用已经相当明显，作用72 h平均抑制率已达29.48%；当浓度提高到200μmol·L-1时，作用24 h、48 h、72 h其平均抑制率分别为45.41%，58.17%，76.04%。可见Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞的增殖抑制作用基本上呈时间、浓度依赖性。本实验为了进一步为Res体外对MIAPaCa-2细胞的增殖抑制作用提供形态学支持并探讨其初步作用机制，采用倒置显微镜和透射电镜对细胞形态进行了观察，结果证实Res作用后，胰腺癌细胞数目减少，并存在明显的细胞凋亡。而且，25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1 Res组凋亡率呈浓度依赖性(P<0.05)(100μmol·L-1与200μmol·L-1 Res处理组之间凋亡率无差异可能是因为大量Res作用后部分凋亡细胞出现自溶或继发坏死,导致凋亡细胞比例不再增加)。
综上所述，Res体外可显著抑制胰腺癌MIAPaCa-2细胞的增殖，诱导凋亡是Res抑制胰腺癌MIAPaCa-2细胞增殖的重要机制，且诱导凋亡作用呈浓度依赖性。凋亡是细胞自身调节的一个程序性死亡过程，它不引起炎症反应，机体亦不会因此而引发不良现象。Res诱导胰腺癌MIAPaCa-2细胞凋亡进一步说明，它对胰腺癌可能有着很好的应用前景；而且，由于Res是天然化合物,在界分布极广，目前体内实验又未发现任何毒副作用,为理想的天然抗癌药物。目前有关Res抗癌作用的机制研究进展很快，但多数还限于实验室阶段，如能彻底了解其抗癌机制，将会使该药物有更广阔的临床价值。
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