重组pDC316-MCMV/ hNIS真核表达质粒的构建及在肿瘤细胞的功能研究

              作者：周泉波， 陈汝福， 李志花， 周嘉嘉， 唐启彬， 陈积圣 

【摘要】  【目的】 克隆人的钠/ 碘同向转运体(hNIS) 基因可编码序列，并研究其在非甲状腺肿瘤细胞内的功能表达。【方法】 利用逆转录和聚合酶链反应（RT-PCR）从毒性弥漫性甲状腺肿（又称Graves病）病人的甲状腺组织中扩增得到NIS的可编码区基因，并克隆到T载体，测序后亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒pDC316载体上，获得重组真核表达质粒载体pDC316–MCMV/ hNIS。采用脂质体转染的方法，把pDC316-MCMV/ hNIS重组质粒（实验组）或pDC316空质粒（对照组）分别导入到胰腺癌细胞株CAPAN-II细胞、PANC-1细胞和卵巢癌细胞株SK-OV-3细胞，转染后48 h采用RT-PCR方法检测转染细胞内的hNIS mRNA水平，转染后第2、3、4天分别检测肿瘤细胞对125I的吸收功能。【结果】 序列分析结果证实克隆片段与报道的hNIS基因cDNA序列完全一致。实验组转染后48 h，在CAPAN-II细胞、PANC-1细胞及SK-OV-3细胞内均能检测到hNIS mRNA高水平表达，对照组基本无hNIS mRNA表达。转染后第3天细胞吸碘达到高峰，实验组CAPAN-II细胞、PANC-1细胞和SK-OV-3细胞对125I的吸收量分别比对照组高24倍、17倍和13倍。【结论】 从Graves病人的甲状腺组织中克隆的hNIS基因转染肿瘤细胞后，能使肿瘤细胞发挥高水平吸碘功能，为进一步运用放射性核素体内靶向非甲状腺肿瘤奠定了基础。

【关键词】  人钠/ 碘同向转运体； 逆转录聚合酶链反应； 基因转染； 碘放射性同位素

     钠/碘同向转运体(sodium iodide symporter,NIS)是主要存在于甲状腺滤泡细胞基底膜上的一种跨膜糖蛋白,在细胞对碘的摄取过程中起着举足轻重的作用[1]。随着对NIS研究的不断深入，通过NIS基因介导放射性核素来进行肿瘤的基因治疗是目前国内外的研究热点之一[2,3],但在胰腺癌基因治疗中少有报道[4]。本研究从Graves甲亢病人的甲状腺组织中克隆出人NIS基因的完整编码区序列（CDS），并构建Pdc316-MCMV/hNIS重组穿梭质粒载体，以研究NIS基因转染的胰腺癌等非甲状腺肿瘤细胞对碘的摄取功能。

    1   材料与方法

    1.1   材料

     Graves甲亢病人的甲状腺组织取自我院乳甲外科。总RNA提取试剂Trizol reagent和脂质体lipofectamine 2000均为Invitrogen公司产品, 2×Pfu PCR MasterMix（KP201）天为时代公司产品，两步法RT-PCR 试剂盒Takara公司产品。限制性内切酶EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Hind Ⅲ及T4 DNA 连接酶购自NEB公司。coli DH5α，pDC316 vector由中山大学肿瘤实验室提供，pGEM-T easy载体本试验室保存。胰腺癌细胞株CAPAN-2购买于中山大学细胞培养室,胰腺癌细胞株PANC-1、卵巢癌细胞株SK-OV-3由本试验室保存。DMEM培养基（GBICO公司）、四季青胎牛血清为威佳公司产品。放射性125I、NaI及KClO4均由中山大学实验核医学实验室提供。

    1.2   NIS基因的扩增及与T载体连接

    采用Trizol试剂法从1例Graves甲亢病人的甲状腺组织中抽提总RNA后, 使用TaKaRa公司反转录试剂盒把RNA反转录成cDNA,具体方法试剂盒说明书。根据重叠PCR方法设计4条引物以扩增hNIS cDNA全长1932 bp的基因片段：P1: ATGGAGGCCGTGGAGACCGGGGAAC；P2: CAAACATGACGATGCCACAGCAGGC；P3: CAGGT CGTGGTGATGCTAAGTGGCT；P4: TCAGAGGTTTG TCTCCTGCTGGTCT。分别建立如下3个反应体系: 体系1（扩增产物为Fragment 1）：取甲状腺cDNA 1 μL ,P1（10 pmol/L）、P2(10 pmol/L) 各5 μL, 2×Pfu PCR Master Mix  25 μL,ddH2O 14 μL。体系2（扩增产物为Fragment 2）：取P3（10 pmol/L）、P4(10 pmol/L) 各5 μL，其余成份同体系1。体系3（扩增产物为NIS基因片段）：把Fragment 1和Fragment 2的PCR产物稀释50倍后混合，取1 μL此混合物作为模版，P1（10 pmol/L）、P4(10 pmol/L)各5 μL，其余成份同体系1。3个体系PCR反应的条件一致，如下:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min ,共作30个循环,最后于72 ℃延伸10 min,产物放于-20 ℃冰箱中冻存。体系3的PCR产物行1%琼脂糖电泳后，胶回收目的片段，并与pGEM-T easy载体相连，以方便保存目的基因及亚克隆到其他载体。连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，利用蓝/白菌落筛选法筛选出阳性克隆, 提取其质粒DNA，进行NcoⅠ + SpeⅠ酶切鉴定。阳性克隆交由上海生物工程公司测序。

    1.3   pDC316-MCMV/hNIS载体的构建

    根据腺病毒穿梭质粒PDC316所包含的多克隆位点，采用PCR方法在hNIS基因两端分别引入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点，设计引物为P5： TAGCGAATTCATGGAGGCCGTGGAGACCGG GG和P6:TAGCAAGCTTTCAGAGGTTTGTCTCCT GCTGG。以上述经测序证实为碱基序列正确的pGEM-T easy/hNIS 质粒作为模版，P5、P6为引物扩增NIS基因，扩增产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后回收，与PDC316载体连接后得到重组质粒PDC316-MCMV/hNIS。重组产物酶切鉴定后转化到DH5α大肠杆菌感受态后，用LB/Amp平板筛选出阳性克隆送上海生物工程公司测序（本节具体方法同上段）。

    1.4   体外转染

    在24孔板中接种处于对数生长期的胰腺癌细胞株CAPAN-2、PANC-1细胞,卵巢癌细胞株SK-OV-3(1×105/ 每孔),18 h后待细胞生长至密度达到90%～95%进行转染。转染过程参考lipofectamine 2000 转染试剂说明书。

    1.5   RT-PCR方法鉴定细胞内的hNIS基因的mRNA

    pDC316-MCMV/hNIS质粒（实验组）和pDC316空质粒（对照组）转染48 h后，Trizol试剂法从肿瘤细胞内提取总RNA,采用TaKaRa公司反转录试剂盒使RNA反转录成cDNA。然后根据hNIS的cDNA序列设计特异性引物P7:GCTAA GTGGCTTCTGGGTTG和P8：GACTGCAGCCAT AGCATTGA,用于扩增hNIS cDNA的部分基因片段（+941 ～ +1 142）,以鉴定细胞内hNIS的mRNA表达水平。反应条件为: 94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共作30个循环,最后于72 ℃延伸7 min，产物电泳分析。

    1.6　  放射性125I吸收实验

    pDC316-MCMV/hNIS质粒转染组为实验组,未经重组的PDC316(不含NIS基因)作为空白对照组1，实验组另设hNIS抑制剂KClO4组做对照2。每组每种细胞取4个复孔, 重复转染3次。转染细胞后第2、3、4天分别进行125I吸收测定。具体方法：细胞用HBSS溶液冲洗2次，在含10 mmol/L HEPES, 10 μmol/L NaI and 0.1 μCi Na125I/mL(pH 7.3)的HBSS溶液中,37 ℃培养1 h，对照组另加入10 μmol/L KClO4, 作为NIS吸碘的抑制剂。倒掉培养液，用冰PBS冲洗2次，然后1 mol/L NaOH裂解细胞，细胞吸125I用γ计数仪测定每分钟计数。

    2   结   果

    2.1   hNIS基因（+348～+2279）的克隆

    PCR扩增的产物电泳鉴定结果见图1，结果证明扩增产物与预扩增片段大小一致。PCR扩增产物亚克隆到重组质粒pGEM-T easy/NIS后,经NcoⅠ + SpeⅠ酶切鉴定，表明插入片段正确（图2）。重组质粒送上海生物工程公司检测碱基序列，插入基因的测序结果与参考序列H.sapiens solute carrier family 5 (sodium iodide symporter),(GenBank accession : NM-000453)的CDS序列完全匹配，同源性为100％。

    2.2   重组质粒pDC316-MCMV/hNIS构建的结果

    构建的pDC316-MCMV/hNIS 重组质粒转化DH5α后，用LB/Amp平板筛选重组子,挑取阳性菌落, 小提质粒分别进行XbaⅠ+EcoRⅠ双酶切和EcoRⅠ+HindⅢ双酶切，酶切产物经电泳分析得到与预期片段大小一致条带（图3）。挑取阳性克隆送测序，重组质粒中的hNIS基因测序结果与T载体内的hNIS基因模版序列一致，与序列同源性为100％。

    2.3   肿瘤细胞内hNIS的mRNA水平

    RT-PCR方法扩增pDC316-MCMV-hNIS质粒转染后肿瘤细胞内hNIS的部分编码基因片段（+941～+1 142），以检测细胞转染后胞内hNIS基因的mRNA表达情况。扩增片段电泳鉴定（图4），结果表明pDC316-MCMV-hNIS质粒转染CAPAN-2、PANC-1和SK-OV-3细胞后都能扩增出约500 bp大小的目的条带，而所有空白组都不能扩增出目的条带。这表明转染组NIS基因的mRNA在CAPAN-2、PANC-1和SK-OV-3均有较高水平表达，而对照组（不含NIS基因）转染后没有hNIS的mRNA表达。

    2.4   肿瘤细胞的125I吸收

    转染后第2、3、4天分别进行细胞125I吸收测定，结果表明实验组转染后第3天细胞吸125I量最高，在CAPAN-2、PANC-1和SK-OV-3细胞内累计量分别为（2 859±225）min-1、（2 650±214）min-1、（3 105±325）min-1，比对照组分别提高24倍、17倍和13倍, 实验组的高水平吸碘均能够显著被KClO4所抑制。结果表明：pDC316-MCMV/hNIS转染组的3种细胞都有较高水平吸收125I的功能，并且这种125I的吸收功能都能够显著被NIS功能抑制剂KClO4所抑制。对照组pDC316质粒（不含NIS基因）转染后3种细胞125I的吸收水平都很低。

    3   讨   论

    钠/碘同向转运体(sodium iodide symporter,NIS)是一种跨膜糖蛋白,属于钠/葡萄糖协同转运体家族。NIS主要表达于甲状腺滤泡上皮细胞，另外在唾液腺、泪腺、胃黏膜、脉络丛、乳腺、卵巢等非甲状腺组织也有低表达[1]。在某些甲状腺疾病如Graves 病患者甲状腺组织中,NIS 的表达量显著超过正常组织。NIS的功能主要是通过转运细胞外相对稀少的碘离子进入甲状腺细胞，而能使胞内碘浓度超过血浆碘浓度的20～40倍。我们采用RT-PCR方法从Graves 病患者的甲状腺组织扩增出NIS，因为扩增序列较长，采用一对引物均未能扩增出NIS基因片段，故选用重叠PCR方法扩增。考虑到重叠PCR引起扩增序列突变概率增加，我们选用了Pfu DNA聚合酶以减少错配或插入引起的碱基突变，结果得到与参考序列完全一致的hNIS编码序列。扩增序列为NIS基因的CDS序列（+348～+2 279），碱基数为1 932 bp，含有完整的阅读框架, 编码643个氨基酸蛋白质。

    随着对NIS深入研究，人们不再局限于NIS在甲状腺疾病包括甲状腺癌的诊断及中运用[2,3]，众多的研究[4～7]已经表明运用NIS介导的核素放射治疗非甲状腺肿瘤已成为可能。Dwyer等[8，9]利用肿瘤相关抗原的特异性启动子驱动NIS在乳腺癌及卵巢癌细胞内靶向表达，并结合I131治疗肿瘤取得了较好的效果。我们用脂质体方法转染重组质粒pDC316-MCMV/hNIS进入胰腺癌细胞株CAPAN-II、PANC-1和卵巢癌细胞株SK-OV-3,运用RT-PCR方法检测出转染的肿瘤细胞内有hNIS的mRNA的高水平表达，而空白组pDC316转染肿瘤细胞后无hNIS的mRNA表达或极低表达。I125吸收试验表明pDC316-MCMV/hNIS转染后的3种肿瘤细胞都有较高水平的吸碘，且在转染后第3天吸碘达到高峰，实验组细胞对I125吸收量是空白组的13倍以上。同时，这种高水平吸碘125能够被hNIS功能抑制剂KClO4所抑制。这充分说明了hNIS转染肿瘤细胞后能正常表达和发挥吸碘的功能，为进一步I131治疗肿瘤的研究打下基础。

    目前，所有的基因治疗载体均难以转导肿瘤全部的细胞，尤其是在体内，因此人们试图赋予治疗基因以“旁观者效应“，从而使未转导的肿瘤细胞也得以被杀灭。由于I131等核素发射的β粒子射程达数毫米，因此，联合应用NIS和放射性核素治疗肿瘤具有明显的优势[10]。并且hNIS基因转导整合了体内基因表达显像和基因靶向性放射性核素治疗的潜能，通过治疗前的精确剂量可实现放射性核素治疗用量的个体化。因此，我们如果能找到适合的特异性启动子驱动NIS基因在肿瘤细胞内靶向表达，则可能实现肿瘤的靶向性放射性核素治疗。

    综上所述，本研究成功地从甲亢患者的甲状腺组织获得了NIS基因可编码区基因的克隆,并构建了PDC316-MCMV/hNIS重组穿梭质粒；并运用脂质体转染的方法将PDC316-MCMV/hNIS重组质粒导入肿瘤细胞，使hNIS能在肿瘤细胞内较高表达并发挥吸碘功能。本试验为进一步运用核素放射作用靶向治疗胰腺癌、卵巢癌等非甲状腺肿瘤奠定了基础, 此进一步的研究正在进行中。

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