SD大鼠二甘醇中毒的肾功能变化规律特点分析

                   作者：顾琳， 黄明星， 彭晓谋， 高志良， 陈规划

【摘要】  【目的】探讨二甘醇（DEG）中毒时肾功能的变化和腹腔途径中毒的特点。【方法】选用健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，腹腔注射8 mL/kg的DEG，于注射前和注射后第2天、5天、7天以及14天尾静脉采血检测血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和CO2结合率（CO2CP），收集死亡大鼠及第7天和14天处死大鼠的肾组织进行病理检查。【结果】 DEG注射后，个别大鼠在8 h内出现死亡，死亡高峰在第5天（死亡率30%），而第7天后无继续死亡发生。死亡率及血生化指标的异常率分析显示，肾损害的高峰也在第5天，近100%大鼠出现肾损害。血Cr、BUN和CO2CP在注射后第2天出现明显改变，以后逐渐恢复。血清Cr和BUN相比，前者更敏感地反映DEG肾损害。肾脏病理显示死亡大鼠有急性肾小管坏死的表现。【结论】 腹腔注射DEG途径可引起大鼠的明显的肾损害甚至死亡。早期出现的严重酸中毒和继而出现的血清Cr显著升高是早期发现DEG中毒的重要线索。Cr和CO2CP随时间的变化规律及病理特点对诊治也有一定的指导意义。

【关键词】  二甘醇； 肾功能； SD大鼠

    Abstract: 【Objective】 To investigate the changes of the kidney function and the features of the intoxication after diethylene glycol (DEG). 【Methods】Healthy SD male rats were given DEG with the dose of 8 mL/kg body weight (intraperitoneal injection I.P.). The level of the serum Cr (Creatinine), BUN (Blood Urea Nitrogen) and CO2CP（CO2 Combining Power CO2CP）were tested before and after the injection the 2nd , 5th , 7th, and 14th day. The nephridial tissue of all the rats was taken for pathological examinations. 【Results】 Some rats died at the 8th h after DEG, the peak time of the death rate appeared at the 5th day (mortality was 30%), there was no new death from the 7th day. The death rate and the level of the serum Cr, BUN, CO2CP showed that the peak time of the DEG poisoning appeared also at 5th day, nearly all the rats showed the damage of kidney functions. The level of serum Cr、BUN and CO2CP changed obviously at 2nd day, but they recovered gradually. Compared with BUN, the level of serum Cr was more sensitive in reflecting the damage of renal function. 【Conclusion】 The rats after DEG can cause obviously kidney function damage or even be lethal. The severity acidosis and the obviously increasing level of serum Cr may be important clues for discovering DEG toxics at the early stage. The regularity of Cr and CO2CP changing with the time after DEG and the pathologic features may be helpful to diagnose or treatment too.

    Key words: diethylene glycol (DEG); kidney function; SD rat

    二甘醇（diethylene glycol，DEG）又名二乙二醇，双（2－羟基乙基）醚，在上常用作吸湿剂、助溶剂、防冻剂和软化剂[1]。上世纪30年代以来，世界先后发生十余次DEG中毒事件[2-3]。近年来主要发生在家，且大多是将其作为药品的配制剂而引起的药物性中毒事件。2006年5月广州中山大学附属第三的住院患者因使用含30%DEG的亮菌甲素而发生了首次静脉途径的急性中毒。尽管DEG对人和动物的肾毒性作用相对明确，但中毒的早期表现和常见肾损害指标的变化规律尚不清楚。为此，本研究以SD（Sprague-Dawley）大鼠为对象，探讨DEG中毒时肾功能的变化规律和腹腔途径中毒的特点，为未来DEG中毒的早期发现提供依据。

    1   材料和方法

    1.1   材料和仪器

    体质量为（200±20）g健康的雄性SD大鼠（SPF级）（购自南方医科大学，许可证号为 SCXK(粤)、2006B00B）；DEG购自美国Sigma公司；CO2结合力（CO2 combining power, CO2CP）用四川省迈克科技责任公司的试剂检测；尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、肌酐(creatinine, Cr）用日本第一化学药品株式会社的试剂检测；生化检测仪是日本的Hitachi 7180 和Olympus 640。

    1.2   方   法

    1.2.1   毒性实验方法   根据预实验的结果，确定DEG的剂量为8 mL/kg。为了观察到2个时间点的病理变化和多时间段的血生化指标的变化规律，本实验设计了2个实验组，处理A组和处理B组，分组方法常见动物毒理实验方法［4］。即将50只雄性SD大鼠随机分组，设空白对照组，生理盐水对照组各10只，处理组A和B各15只。生理盐水对照组腹腔注射生理盐水8 mL/kg处理A组及处理B组分别腹腔注射DEG 8 mL/kg，空白组不做处理。在处理前（注射DEG或生理盐水）前24 h和处理后24 h，各组大鼠尾静脉采血约0.5 mL，A组大鼠第5天采血0.5 mL并全部处死。B组大鼠于第7天和第14天各采血0.5 mL，并于第14天采血后全部处死。实验过程中死亡的大鼠和处死大鼠立即解剖取大鼠肾脏于8％多聚甲醛固定用于病理检查。

    1.2.2   样本检测   血清CO2CP、BUN和Cr的检测在全自动生化仪上按说明书操作。肾组织的病理标本用8％多聚甲醛固定后常规石蜡包埋、切片HE染色，并由两个有经验的病理医师阅片并发出病理报告。

    1.2.3   统计处理   采用SPSS 11.0软件分析。不同时间处理组之间的差异用t检验。处理前的各类检测结果各指标的正常参考值的基线水平，并根据其上下限（95%正常范围）进行异常率的比较，采用?字2检验进行统计分析。

    2   结   果

    2.1   毒性实验结果

    2.1.1   病理结果   处理组A和B的大鼠在DEG注射后2 d内共死亡3只（10％）， 5 d内共死亡9只（30%），B组第5天后，无新的大鼠出现死亡。空白对照和生理盐水对照组均无大鼠死亡。死亡大鼠的肾组织与对照组（见图1）相比较，可见其部分肾小球血管扩张充血，系膜增厚，囊腔狭窄；部分肾小球囊壁层、脏层基底膜融解消失，肾小球毛细血管内皮变性坏死；近曲肾小管上皮弥漫性水肿变性，散在坏死，管腔消失；部分肾小管基底膜融解消失，部分肾小管管型内可见蛋白管型；间质血管明显充血，未见明显炎细胞浸润（图2，3）。

    实验组大鼠肾组织在光学显微镜下可见不同程度的毒性损害，我们根据肾组织损害的范围分成由轻到重分成四级，分级标准为，“I级”平均一个视野内约25％肾组织出现急性肾小管坏死的病变；“II级”平均一个视野内约50％的肾组织出现肾小管坏死的病变；“III级”平均一个视野内约75％的肾组织出现肾小管出现坏死的病变；“IV”平均一个视野内几乎全部肾组织的出现急性肾小管坏死的病变。处理A组第5天处死的大鼠中，18%的大鼠肾脏病理分级为I级，共有45％的大鼠病理改变达到II级以上。第14天处死的B组大鼠中，20％的大鼠病理改变达到I级，而无大鼠的肾脏损伤达到II级以上。（表1）

    2.1.2   血生化结果   对照组的Cr、BUN和CO2CP结果在不同时间观测点之间没有显著差别，且与处理组的DEG注射前的结果也无显著差异。处理组存活大鼠的生化结果分析见表2和3。血生化结果的定量分析显示DEG注射后2 d的Cr、BUN和CO2CP均有显著改变（表2），并在观察的14 d内均逐渐恢复，且表现为CO2CP恢复最快，其次BUN，最后是Cr。此外，CO2CP在第7～14天仍显著升高。为了进行各生化指标异常率的分析，本研究首先根据50只大鼠处理前血清的检测结果，出Cr、BUN和CO2CP的均值和标准差分别为（24.78±3.29）mol/L、（7.55±1.73） mmol/L和（17.58±2.71） mmol/L，再计算正常值（95%正常范围）的结果为：Cr正常上限为30.2 mmol/L，BUN正常上限为10.4 mmol/L和CO2CP正常下限为13.1 mmol/L。以这些正常参考值为依据的定性分析结果见表3。Cr、BUN和CO2CP的最高异常率分别发生在DEG注射后的第5天、第5天和第2天。

    2.1.3   肾功能损害的综合分析   大鼠的死亡率和血清中Cr和BUN变化的的异常情况进行肾损害的综合分析，具体结果见图2。如图所示，随着时间的增加，大鼠的总的死亡率也在一直增加，到第14天时达到高峰（33.3%）；从血BUN定性分析看，BUN随时间的增加率与死亡率叠加形成的曲线可知：该曲线的高峰发生在第5天（86.0％），直到第14天时才逐渐恢复（33.3％）；而从血Cr定性分析看，Cr随时间的增加率与死亡率叠加形成的曲线可知：该曲线的高峰也在第5天（100％），直到第14天时逐渐恢复到60.0%。即DEG注射后早期（第5天），实验组大鼠血BUN，Cr增加率都达到高峰，与死亡率平行，第14天时总的死亡率为33.3％，而实际上从第7天开始，没有新的大鼠出现死亡。DEG注射后晚期（第14天）各项肾功能的血生化指标逐渐恢复，BUN恢复为（8.26±1.17） mmol/L，Cr恢复为（30.72±5.03） μmol/L。

    3   讨   论

    DEG相关药物性中毒事件近年来不断发生，主要为口服途径中毒。DEG在消化道吸收良好，并通过血液快速分布到肾、脑、睥、肝、肌肉和脂肪等部位[5]，但临床上主要表现为急性肾功能损害，是动物和人中毒死亡的主要原因。然而，2006年5月在广州发生的属首次静脉中毒事件,也是我国首次发生DEG中毒的重大事件。尽管本研究因可导致注射部位严重坏死而未能观察到静脉途径中毒的情况，但观察到了采用腹腔注射途径也可引起大鼠死亡和肾功能血生化指标的显著异常。

    2001年张国华等[6]发现二甘醇中毒的肾组织病理表现为严重的急性肾小管坏死的表现，如弥漫性肾小管坏死的改变，特别是近曲小管。本实验研究发现死亡大鼠的肾损害也主要是急性的肾小管坏死，尤其是近曲小管可见上皮细胞弥漫性水肿变性，散在坏死，管腔消失等严重表现。提示人类二甘醇中毒机制与SD大鼠中毒的机制类似，即均可以导致急性肾衰而引起大鼠死亡。此外从表1的结果可知早期（第5天内）死亡和处死的大鼠的病理分级在Ⅱ级或以上的有45％，而晚期（第14天），无大鼠的肾脏损伤达到Ⅱ级以上。因此提示DEG中毒肾组织损伤主要发生在早期（第5天），但是随着时间的延长，中毒大鼠的肾损害可能会逐渐恢复。

    8 mL/kg的DEG灌胃途径染毒已有显示可引起大鼠发生肾损害[7]。本研究使用该剂量进行腹腔注射显示，个别大鼠可在8 h内死亡，死亡高峰在第5天，死亡率约为30%，而第7天后无新的死亡发生。大鼠的死亡率结合血生化指标的异常率综合分析显示，DEG注射后第5天是肾损害的高峰，可以证明大鼠的死亡主要是由于急性肾功能衰竭引起死亡的。在时间上，我们的实验大鼠的死亡时间与国外文献报道的4～8 d相吻合[7]。进一步分析显示，血生化指标，Cr、BUN和CO2CP在注射后第2天出现明显改变，以后逐渐恢复。其中CO2CP下降最明显，且于第5天迅速恢复，到第7～14天出现显著升高。Cr恢复最慢，到第14天其平均水平仍然显著升高。血清Cr和BUN相比，前者在反映DEG肾损害更敏感。以上提示，早期出现的严重酸中毒和继而出现的血清Cr显著升高是早期发现DEG中毒的重要线索。

    综上所述，DEG的腹腔注射途径可以引起大鼠的明显的肾功能损害甚至死亡，包括肾组织出现的急性肾小管坏死的病理改变。早期出现严重的酸中毒和Cr的显著升高为DEG中毒的早期诊断提供重要线索，同时Cr和CO2CP随时间的变化也有助于我们深入了解DEG中毒的特点，并提示部分大鼠的肾功能变化是可能是可逆的，这些均有利于指导临床的，但DEG中毒引起肾中毒的具体机制尚需进一步研究。

【参考文献】
  周邦荣.二甘醇应用前景广阔[J].精细化工原料及中间体,2006,(3):22-24.

蔡皓东.1937年磺胺酏剂(含二甘醇)事件及其重演[J].药物不良反应, 2006,8(3):217-220.

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张国华，陈丽萍，胡更奕，等. 二甘醇中毒死亡1例 [J]. 法医学杂志,2001,17(4):236-237.

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