微透析技术在脑组织研究中的应用
作者：陈银生，庄明华，姜苏明
微透析技术是将推挽灌流和透析技术结合起来并逐渐完善的一种新型生物采样技术,可在麻醉或清醒的生物体上使用,特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。微透析技术最早应用于脑内是在1972年美国耶鲁大学报道的猴脑的微透析研究，之后微透析即开始应用于对脑内神经递质的改变，药物动力学监测以及一些疾病脑内神经生理改变的研究，至今已有30多年的。本文就微透析技术在脑组织研究中的应用作一综述。
1 微透析技术的原理及探针回收率的测定
微透析技术是以透析原理作为基础的在体取样技术，是在非平衡条件下即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中的浓度，灌注埋在组织中的微透析探针，组织中的待测化合物沿浓度梯度扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的，通过测定流出液即透析液中待测物的浓度来研究组织中待测物的水平。这是一种动态连续的取样方法。简单地说，微透析技术的原理就相当于在组织中创造了一个“毛细血管”，使化合物在浓度差的作用下扩散而进入此“毛细血管”，然后随液体流动带出体外进行检测。
微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生理过程的情况下进行在体、实时和在线取样,透析过程探针周围的组织液成分不会发生改变，所以可以持续收集样品，而且被透析动物可以小到老鼠一般大小。通过微透析技术可以单独取得细胞外液,因此可对大脑神经递质进行活体监测［1］，由于透析液中不含蛋白质和酶等生物大分子，能直接进样进行高效液相和毛细管电泳等生化分析，免除了复杂的进样前样品处理及由此而产生的样品损失和误差，也不会因在室温取样而酶解，提高了样品的稳定性，而且随着技术的进步可以对微透析试验进行全程的自动化控制。
微透析试验中一个重要的步骤是要测定微透析探针的回收率(透析液中待测化合物的浓度与其在样品基质中浓度之比)，由于微透析是在非平衡条件下取样，所以所测得的透析液中化合物的浓度只是探针周围样品基质中该化合物浓度的一部分。在了解该化合物待测部位的实际浓度时必须测定探针的回收率，它是影响微透析结果的重要因素，并取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质(材料，孔径，长度，几何形状等)、待测物质的分子量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等［2］。
探针回收率有体内、体外之分，体外的测定方法比较简单，配制被测物质的标准溶液进行透析，测定透析液中该物质的浓度，再与标准溶液浓度进行比较即可得出。体内的测定则较复杂，常用的体内测定方法①零净通量法，该法是将灌流液流速控制恒定,分别测定不同浓度的灌流液达到稳态后透析液中分析物的浓度。当灌流液中分析物的浓度低于探针外介质时，扩散方向就是从介质到探针；反之，即是从探针到介质。零通量点时，探针内外浓度相等。绘制灌流液不同浓度与透析液中分析物浓度的直线回归图，这时斜率即为探针回收率［3，5］。此法是一种带有尝试性的方法，需要对分析物在体内的浓度范围有一定的了解。②反透析法是用一种内标物加入到灌流液中进行透析，通过测定透析液中内标物的浓度，与灌流液浓度做对比，用1减去该比值即为该物质的体内回收率［4，5］。这种内标物要求具有惰性，不与体内物质反应且又尽可能与待测物结构性质相近。该法优点在于可真实反映体内回收率的变化情况。③低速灌流法［2，3］，在灌流速度约为50nL/min时进行灌流，一般相对回收率可达90%。这种方法的缺点是显而易见的，不但在样本采集时耗时，且在灌流过程中样品挥发程度也很严重。
在只需要知道被测物质的相对浓度变化时，可简单的测定探针的体外回收率，测定应在透析前进行，配制被测物质的标准溶液(浓度要与该物质在体内的浓度相似)，用与体内试验相同的灌流速度灌流探针，达到稳定状态后收集透析液并进行检测，测定浓度与标准液浓度之比就是探针的体外回收率。此法虽简单易行，但由于被测物质在体内、外的状况不同，检测结果不能严格的等同于体内回收率。
2 微透析系统的组成及脑内微透析的操作步骤
目前国际上生产微透析系统的公司主要有：瑞典CMA公司，美国BAS公司，以及日本的EICOM公司，我们使用的是美国BAS公司的产品。院北京化学研究所［6］，中国科学院上海生物研究所，天津神经外科研究所都较早地开展了微透析技术，而且可以自行设计微透析探针并申请了国家专利［7］。
微透析系统主要有：微量灌注泵，与微量灌注泵相配套的微量注射器，连接管，微透析探针，与探针相配套的微透析套管以及微透析分段收集仪。另外在透析清醒大鼠时还需要一套光感应收集笼以保证大鼠在透析过程中可以自由活动而不影响透析过程。其中最关键的部分是微透析探针，它是由导入管,导出管,中空纤维管,半透膜组成。BAS公司有3种不同设计风格的探针(针式、直线型、分流型)。该公司提供的可选择探针有脑探针,主要用于脑组织及脊髓组织的透析；联合灌注脑探针主要用于脑组织，可以同时进行透析和灌注；脉管探针主要用于血管、肌肉、皮下组织、腹膜等组织部位的透析；线型探针主要用于真皮、肌肉、肝脏、胰腺、肾脏等部位的透析；环型探针主要用于皮下组织,分流型探针主要用于检测胆汁成分的变化。另外依据探针的形状又可将其分为U型、I型、线性和环形探针［8］，其中U型、I型探针由于其体积小，对脑组织损伤小常用于脑内微透析，而线型、环型探针的使用同上所述。每种探针都有几种不同长度的半透膜供选择。试验中探针的选择主要依据所透析的部位以及靶组织的尺寸，不必完全拘泥于探针的设计风格。
对于脑内的透析试验，为防止探针膜的损伤，在试验前应先在麻醉状态下，给大鼠脑部植入微透析探针引导管,依照大鼠脑立体定位图谱，借助立体定位仪找到目标部位植入微透析探针引导管，手术后3～4d大鼠恢复自由活动后开始对其进行透析，试验时先将微透析系统连接好，冲洗探针(探针膜被甘油封存着，使用前应先将其冲洗掉)，探针准备好后，拔出大鼠脑部引导管内芯将微透析探针插入，用微灌注泵通过探针的进液管，向探针内以恒定的速度灌流与脑组织液成分相似的等渗灌流液，此时膜外小分子物质将顺浓度梯度进入灌流液中，并随灌流液通过探针的导出管被引流出来，调整分段收集仪,一定时间段收集一次液体(BAS公司分段收集仪可直接在0～4℃环境中收集液体，有效避免了样品在空气中的降解)，由于透析过程中大分子量物质不能通过透析膜，收集到的液体可以直接注入高效液相色谱仪或毛细血管电泳仪进行定量检测［9］。
3 微透析技术在脑组织中的应用
脑内微透析技术是刚刚起来的一种在体研究脑内神经递质活动的方法，微透析技术结合高灵敏度的微量化学分析技术可以精确测定脑内特定脑区神经递质的变化情况。
利用微透析技术进行动物试验，主要是在被限制动物或在麻醉动物身上，也可以用在自由活动的清醒动物(需要设计能供动物自由活动的光感应笼)。Bagger等［10］将微透析技术应用于经鼻黏膜给药后药物在脑内代谢过程的研究，探讨了药物经嗅觉区吸收的模型。邓小明等［11］利用微透析技术对大鼠脑缺血再灌注损伤进行研究，认为谷氨酸(Glu)与天门冬氨酸(Asp)等兴奋性氨基酸在缺血性神经细胞损伤中起关键作用，缺血时间越长脑间质Glu与Asp的峰值浓度就越高，神经病和神经学损伤也就越严重。在老年医学的研究中，院上海生理研究所利用微透析技术对老龄大鼠和年轻大鼠皮层胆碱能神经系统的功能进行活体监测，检测出老龄大鼠皮层乙酰胆碱(Ach)的基础水平显著低于年轻清醒大鼠皮层Ach的基础水平,为进一步探讨老龄大鼠与年轻大鼠学习记忆方面差别的机理提供了证据［12］。脑内微透析技术已经成为研究各种动物模型脑内神经递质变化不可缺少的方法，国内众多实验室都在逐渐开展微透析技术，以便更清晰准确地反映一定条件下脑内神经递质的变化情况。
脑内微透析技术近几年在临床也有较多应用，Hutchinson等［13］利用微透析技术与其它监测手段研究动脉瘤手术的情况得出：患者稳定期脑氧压在15～45mmHg之间，葡萄糖含量在(0.5～3)mmol/L之间，乳酸/丙酮酸比值大于30，则提示有厌氧代谢的可能；小于3min的短暂动脉夹闭不会引起脑氧量减少或乳酸/葡萄糖比值的升高，长时间夹闭则会有副作用。有研究，微透析能在患者脑缺血局部脑氧分压和脑血流量出现变化后5～30min即发谢物的变化，早于临床症状，为临床提供了更大的空间［14］。在国外微透析技术和设备已经逐渐标准化，被作为一种常规方法应用于神经外科手术和神经内科疾病的监护治疗，并能提供正常值来评价患者透析期间的变化，大大降低了患者的死亡率［15］。目前微透析技术应用于临床的疾病主要涉及颅脑损伤，蛛网膜下隙出血，癫，帕金森氏病，脑肿瘤等，但国内有关脑内微透析技术应用于临床的报道还很少。
4 结语
脑内微透析技术为研究脑内的递质改变，损伤变化以及药动学监测提供了有效手段，但该技术仍存在一些缺陷：植入套管手术对脑的刺激，相对回收率较低，透析量微少对检测手段提出很大挑战，而且由于微透析收集的透析液量在一定时间内受到限制，每个时间点收集的透析液量一般仅可用于1～2次高效液相的测定，意味着一般只能得到1～2种生物活性物质的信息，如果一次进样能够得到多种物质信息将大大节约成本和时间而且提高研究水平。同时国内微透析设备主要还是依靠进口，高质量微透析探针的国产化，是推动该技术发展的主要动力。微透析技术在脑内的科学研究已显示出其巨大的生命力，相信其会得到更快更好的发展。
【参考】
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