棒曲霉菌中抗真菌肽的分离与纯化

【关键词】  ,棒曲霉菌;分离;真菌蛋白类

       ［摘要］ ［目的］ 从棒曲霉菌培养上清液中分离纯化具有抗真菌活性的肽类物质（AFP）. ［方法］ 用离子交换柱层析法分离AFP，利用反相高效液相色谱法进一步纯化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确定相对分子质量. ［结果］ 从棒曲霉菌培养上清液中分离出1种具有抗真菌活性的AFP，纯化后得到高活性的精制AFP，相对分子质量约为8ku，MTT法测定结果表明AFP对5种真菌均具有明显的抗真菌作用. ［结论］ 棒曲霉菌培养上清液中含具有抗真菌活性的AFP.

　［关键词］  棒曲霉菌;分离;真菌蛋白类

   ABSTRACT:OBJECTIVE To purify the peptide with antifungal activity from Aspergillus clavalus desm culture fluid.METHODS The peptide was separated by ion exchange column chromatography and further purified by reverse phase HPLC，and the molecular weight was determined by tricine gel electrophoresis.RESULTS A kind of peptide with antifungal activity was separated.The molecular weight was about8ku.The detection result by MTT method showed significant antifungal activity of the peptide to5kinds of fungi.

    CONCLUSION There has antifungal peptide in Aspergillus clavalus desm culture fluid.Key words:Aspergillus clavalus desm;dissection;fungal proteins

    真菌在界分布广泛，其中有些真菌可使人致病，而在有些真菌中则可提取抗生素或防腐剂等.本文从棒曲霉菌（Aspergillus clavalus desm）培养上清液中分离得到具有抗真菌作用的肽类物质真菌抑制肽（antifungal peptide，AFP），旨在为抗菌药物及防腐剂的开发提供依据.

　1 材料与方法

    1.1 材料  棒曲霉菌菌种由韩国技术研究院生命工学研究所提供;CM-Sepharose离子交换树脂为瑞典Pharmacia公司产品;YPD，YM培养基及MTT试剂为美国DIFCO公司产品.超滤浓缩系统 为Millipore公司产品;700型高效液相色谱仪和 500型酶标仪为美国BIORAD公司产品;全自动层 析仪为北京应用新技术研究所产品.

　 1.2 方法

    1.2.1 粗提液的制备  将棒曲霉菌置于YPD培养液中，振动培养（30℃）72h，取上清液用超滤方法（膜截留分子质量为30ku）除去大分子蛋白，取滤过 液，4℃保存，待进一步纯化.

    1.2.2 CM-Sepharose离子交换柱层析  用0.1mol/L Tris-HCl（pH值为7.0）缓冲液，将CM-Sepharose柱（30cm×26cm）洗柱平衡，待稳定后将粗提液上柱，速度为80mL/h，完毕后用0.1mol/L Tris-HCl（pH值为7.0）缓冲液洗柱，然后用含1.0mol/L氯化钠的0.1mol/L Tris-HCl（pH值为7.0）缓冲液进行洗脱，利用紫外分光光度仪于波长280nm处进行检测，记录洗脱曲线，收集出现峰值的洗脱液.

    1.2.3 反相高效液相色谱法（RP-HPLC）  色谱柱为C 18 反相柱;流动相:A液为0.5g/L三氟乙酸，B液为800mL/L乙腈加0.5g/L三氟乙酸，流动速度为1.8mL/min，检测波长为214nm.将离子交换层析后收集的洗脱液经除盐浓缩后上柱，每次进样量为10μL，梯度洗脱，分别收集洗脱峰，冷冻干燥，冻干品即为AFP样品 ［1］ .

    1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳  主要组成为160g/L聚丙烯酰胺（含5g/L N，N-亚甲基双丙烯酰胺），110g/L甘油，1g/L SDS.电极负极缓冲液为0.1mol/L Tris-甘氨酸（pH值为8.2，含1g/L SDS）缓冲液，正极为0.2mol/L Tris缓冲液（pH值为8.9）.25mA电泳6h，行弱酸性艳蓝G染色.

    1.2.5 抗真菌活性测定  采用MTT法进行 ［2］ ，即取烟曲霉菌、黑曲霉菌、白色念珠菌及茄病镰刀菌4种菌，分别用YM培养液加至96孔平底培养板上，每孔0.1mL，菌数为2×10 8 个/L，待稳定后向每孔加入倍比稀释的AFP样品，作用24h（30℃），每孔加入10μL MTT溶液，继续培养4h，每孔加入200g/L SDS溶液20μL，作用2h，用酶标仪于波长405nm处检测吸收值.

　 2 结果

    粗提后的AFP样品经CM-Sepharose柱层析后，收集1个大洗脱峰（图1）.RP-HPLC梯度洗脱得3个洗脱峰，其中峰1的峰值最高且对称，单独提取峰1并测定抗真菌活性，证实为高度纯化的AFP（图2）.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现，在相对分子质量约为8ku处AFP样品有一明显的蛋白带（图3）.抗真菌活性测定结果示从棒曲霉菌中分离纯化的AFP对4种真菌均具有抗真菌效应，其中对曲霉菌属和念珠菌的抗真菌效应优于对镰刀菌，见表1.图1 CM-Sepharose离子交换柱层析洗脱图（略） 图2 反相高效液相色谱法洗脱峰（略）

　3 讨论

    本文应用离子交换层析法，首次从棒曲霉菌培养上清液中分离出具有抗真菌活性的多肽AFP，并应用RP-HPLC法对其粗提液进行了进一步纯化，得到高活性的精制AFP，其多肽相对分子质量约为8ku.MTT法测定结果表明，纯化的AFP具有明显的抗真菌活性，且对曲霉菌属和念珠菌属的抑菌作用优于镰刀菌属，与金哲洙等 ［3］ 对烟曲霉菌的研究结果基本一致.本实验结果提示，AFP作为抗真菌 药物用于临床，某些真菌感染性疾病，亦可作为 防腐剂用于食品、饮料、药材及农副产品等的保鲜.

　［参 考 文 献］

    ［1］ Morgan DK，Brown DM，Rotsch TD，et al..A re- versed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination and identification of clarithromycin as the drug substance and in various dosage forms［J］.J Pharm Biomed，1991，9（3）:261.

　［2］ 张笑人，魏海明，孙广莲，等.MTT法检测细胞因子抗原细胞毒效应［J］. 上海免疫学杂志 ，1997，17（5）:290.

    ［3］ 金哲洙，王玉书，金京玲，等.烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化［J］. 生化药物杂志， 2001，22（1）:13.