红毛五加多糖对荷人喉癌裸鼠抗癌作用的研究
刘国龙 毛海波 伍勇 翁成荫 吴红瑛
【摘要】 目的采用人喉癌裸鼠移植模型及电镜观察，研究红毛五加多糖的抗肿瘤药理作用和可能机制。方法建立人喉癌裸鼠移植模型，观测红毛五加多糖（AGP）与对照组的抑癌率；电镜观察 AGP 引发的癌细胞超微结构改变。结果AGP 对裸鼠移植人喉具有明显的抑制作用，平均抑瘤率为 47.21% ，对荷癌裸鼠体重增长无明显抑制作用，透射电镜观察发现AGP可诱导大量肿瘤细胞凋亡和少量直接坏死。结论 AGP 对人喉癌有明显的抑制作用，诱导癌细胞凋亡是其主要作用机制，对实验动物的生长无明显影响。
【关键词】 红毛五加多糖 裸鼠移植瘤模型 人喉癌
Abstract：ObjectiveTo study the anti-tumor effect of AGP on nude mice inplanted with human laryngeal carcinoma cells and its machanism.MethodsThe tumor inhibitory rate was measured on nude mice implanted with human laryngeal carcinoma cells and the super-microstructure change of cancer cells was observed by transmisssion electron microscope.ResultsThe inhibitory rate of the implanted cancer in AGP group was 47.21%,transmission electron microscope observation results showed that AGP induced cell apoptosis more than direct necrosis.ConclusionAGP can inhibit the growth of implanted human laryngeal carcinoma cells by inducing apoptosis .AGP has no side effect on growth of nude mice in this trial.
Key words：AGP; Nude mice model ; Human laryngeal carcinoma
喉癌(laryngeal carcinoma)是头颈部常见的恶性肿瘤。目前喉癌的仍以手术为主。晚期喉癌术后多辅助放射治疗和化学治疗。但喉癌对目前的常用化疗药物反应较差，多联多周期化疗时毒副反应明显。红毛五加多糖(canthopanax giraldil Harms var hispidus Hoopolysaccharides,AGP)是中药红毛五加的地上茎皮水溶性提取物经分离纯化得到的精华成分。多糖类具有增强免疫功能、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性［1］。近 10 年来有关AGP 辅助抗癌的研究报道很多，但未见对喉癌的研究报道。本文通过人喉癌裸鼠移植模型观察AGP 对人喉癌的作用，并通过电镜观察探索其可能的机理。
1 材料
1.1 药品与试剂AGP ，由广州市第一人民制剂科提供；阳性对照药猪苓多糖注射液（zhu ling polysaccharide,ZP），连云港正大天晴制药有限公司产品；环磷酰胺（cyclophospha-midum,Cy），上海华联制药有限公司产品。
1.2 动物与瘤株BALB/c系裸小鼠（mudemice,NM），由南方医科大学动物实验中心提供，6～8 周龄雌雄兼用，放置在空气净化室内繁殖、饲养、室内保持（25±2）℃。全部实验过程达到SPF(SpectficPathogen-free)条件。人喉癌瘤源（CNE-1）由南方医科大学中心实验室提供。
2 方法
2.1 喉癌接种将瘤源裸鼠脱颈椎处死，取出喉癌肿瘤组织，切成2 mm×2 mm×2 mm 的小瘤块，用套管针将瘤块接种于每只裸鼠的背部皮下，形成人喉癌裸鼠模型。
2.2 动物分组及实验方法裸鼠 48 只，接种后次日随机分为 4 组，即空白对照组、Cy组、ZP组、AGP组。实验组于接种 24 h 后每只皮下注入红毛五加多糖液 0.2 ml ，对照组在同样条件下分别每只皮下注入生理盐水＼猪苓多糖注射液＼环磷酰胺每只 0.20 ml（调节药物浓度使药量达到10 mg/kg 体重），1次/d，连续 30 d。各组裸小鼠分别从给样品后15 d 起每3天做1次活体肿瘤大小测量，以最大长径（L）和横径（S）按下式肿瘤体积（V），绘制不同治疗组肿瘤生长曲线，V（mm3）=0.5×L×S2。停药次日处死动物，按下式计算抑瘤率：
抑瘤率（%）=1-给药组平均瘤重对照组平均瘤重×100%
电镜观察：处死动物后，立即取出0.5～1 mm3 大小的癌细胞，迅速侵入预冷的前固定液（2.5% 戊二醛加 2% 多聚甲醛）固定 4h ，再用 1% 锇酸作用后固定 2 h ，酒精、丙酮梯度脱水，Epon812 渗透包埋，LKB 型超薄切片机切片，铀铅双重染色，在投射电镜下进行观察。
3 结果
实验结束时全部实验裸鼠均存活。
3.1 对裸鼠体重增长的影响结果见表1。空白对照组裸鼠的体重与 30d 前比较，体重增加显著（t值检验，P＜0.001）；与空白对照组比较：AGP组P＞0.05；ZP组P＜0.05；Cy组P＜0.01。AGP 对实验裸鼠的生长无明显影响。而 ZP 与 Cy则有不同程度的抑制作用。表1 AGP 对荷人喉癌裸鼠体重的影响（略）
3.2 对人喉癌生长的影响空白对照组肿瘤生长最快，ZP 组肿瘤生长次之，肿瘤的抑制率为 28.83%～41.36%。AGP组肿瘤生长第3，对肿瘤的抑制率为37.58%～51.47%。Cy 组肿瘤生长最慢，对肿瘤生长的抑制率为 73.26%～77.93%。
3.3 对人喉癌的作用结果见表2。AGP连续给药 30 d 的荷人喉癌裸鼠，其瘤重抑制率为 47.21%，有明显的抗肿瘤作用（P＜0.01）。表2 AGP 裸鼠移植人喉癌的抑制影响（略）
3.4 对人喉癌肿瘤细胞结构的影响空白对照组癌细胞均匀分布，胞膜完整，胞内染色质分布较均匀，可见基本正常的细胞器，除极少数坏死瘤细胞外，未见凋亡瘤细胞。CY组癌组织内主要为细胞坏死，未见明显凋谢现象，ZP与AGP 组有较多的癌细胞出现凋亡的特征，表现为细胞皱缩，胞浆密度增高，染色质在核膜下浓聚、边集，细胞间出现大量的凋亡小体，有少数变性坏死的癌细胞。提示 AGP 通过诱导喉癌细胞凋亡是产生抑癌作用的主要机制。
4 讨论
红毛五加多糖具有增强免疫功能、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性［2，3］。
实验结果可见，给予 AGP 的荷人喉癌裸鼠，抑瘤率为37.58%～51.47%，平均抑瘤率间于 Cy 与ZP之间，表明 AGP 有确切的抑癌作用。另 AGP 和 Cy 组有着不同的肿瘤生长曲线，提示AGP 的抗癌作用不同于Cy 对癌细胞的直接杀伤。
人体肿瘤裸鼠移植瘤模型在抗肿瘤药物研究中的应用日趋广泛，尤其在新抗肿瘤药物的筛选、对特定类型肿瘤的药效学评价及肿瘤导向治疗研究中具有重要的作用［4］。药物对异种移植的人体肿瘤的作用与药物的临床疗效有良好的相关性［5］。本研究采用荷人喉癌裸鼠研究所得出的结果准确可靠。
近年来研究表明，细胞凋亡与肿瘤的发生密切相关，诱导癌细胞凋亡是肿瘤治疗的一条新途径。放疗、热疗、抗体、淋巴因子等均可促进肿瘤细胞凋亡［5，6］。筛选能诱导癌细胞凋亡的药物是寻找肿瘤治疗新靶点，制定综合治疗新策略的方向之一。电镜观察是鉴定细胞凋亡的最佳选择之一。本实验结果可见 AGP 组出现大量典型的癌细胞凋亡现象，由此可见 AGP 抑癌作用机制的主要机制是 AGP 能诱导癌细胞凋亡。
本研究表明 AGP 对荷人喉癌裸鼠具有明显的抗癌作用，给予 AGP 的裸小鼠在实验中一般状况良好，未见明显的毒副作用。化疗是喉癌综合治疗中的主要治疗手段之一，但是由于化疗药物的毒副作用及肿瘤耐药的增加，限制了其长期应用。AGP 作为一种低毒有效的中药制剂将为喉癌的综合治疗提供新的选择。
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［6］吕晓英,曾令福,杨培全,等.红毛五加多糖诱导胃癌细胞凋亡研究［J］.新药杂志，2000，9（3）：166.
