半夏泻心方及配伍药组含药血清抑制人胃癌BGC823细胞增殖的实验研究
作者：王萍，李娟，刘喜平，李德兴，高波
【关键词】 半夏泻
摘 要：目的：研究半夏泻心方及其配伍药组对体外人胃癌BGC823细胞增殖的影响 。方法：采用血清药方法和MTT法及台盼兰染色法观察半夏泻心方及其配伍药组对体外人胃癌BGC823细胞的敏感性及生长抑制作用。结果：辛苦组对人胃癌BGC823细胞的生长抑制作用最强，显著高于辛开组、苦降组、辛甘组、苦甘组、甘补组（P<0.05）。结论：半夏泻心方中对BGC823细胞增殖起主要抑制作用的药组为辛开、苦降的配伍形式。辛开、苦降配伍后（辛苦）有显著的协同增效趋势，而其他配伍药群可能存在拮抗作用。提示辛开苦降法可能是中医药防治胃癌的治则治法之一。
关键词：半夏泻心方；人胃癌BGC823细胞；配伍；生长抑制
半夏泻心方为传统经方，药少力专,配伍严谨，为脾胃病的代表良方，其研究也显示出了多方面的消化系统作用机理〔1〕。近年来本方在胃癌的防治中已有一定的临床应用〔2-4〕，但至今尚未见到该方抗肿瘤的相关基础研究。为此，我们采用血清药理学和分子生物学的方法及实验技术，紧密结合半夏泻心方所反映病机的配伍关系，对半夏泻心方及其配伍含药血清对体外人胃癌BGC823细胞的增殖进行了初步研究，以期进一步为研究半夏泻心方抗肿瘤的机制奠定基础。现报告如下。
1 实验材料
1.1 动物
家兔20只，体重2.0～2.5 kg,由兰州生物制品研究所实验动物中心提供。
1.2 药物及试剂
半夏泻心方药材由甘肃中医学院附属提供，经甘肃中医学院中药鉴定教研室鉴定符合药典规定；含10 %胎牛血清的RPMI1640培养液； 0.25 %胰蛋白酶消化液；5-氟脲嘧啶（5-Fluorouracia，简称5-FU），临用时用RPMI1640培养液稀释至所需浓度。
2 实验方法
2.1 药物制备
依据原方比例〔5〕，按中医理论及配伍分为7组：全方组（半夏12 g、干姜9 g、黄芩9 g、黄连3 g、人参9 g、大枣4枚、甘草9 g）、辛开组（半夏12 g、干姜9 g）、苦降组（黄芩9 g、黄连3 g）、辛苦组(半夏12 g、干姜9 g、黄芩9 g、黄连3 g)、甘补组（人参9 g、大枣4枚、甘草9 g）、苦甘组（黄芩9 g、黄连3 g、人参9 g、大枣4枚、甘草9 g）、辛甘组（半夏12 g、干姜9 g、人参9 g、大枣4枚、甘草9 g）。将各组药物饮片浸泡30 min，煎煮两次，每次 30 min，纱布粗滤去渣，全方药液浓缩为含生药2 g/mL，其他配伍煎液中生药量同原方，煎法相同，煎后浓缩体积与全方煎液相同，使各配伍组中生药浓度与全方中各相应生药浓度相同。
2.2 含药血清的制备
参照李振光等〔6〕文中的方法：每组选家兔2只，实验前禁食12 h，灌胃给药，各药物组每只家兔灌服试验药物，对照组给予相同体积的生理盐水。给药剂量：每次26 mL/kg，相当于60 kg成人日服用量的10倍；给药方式：连续灌胃3次，第1、2次间隔20 h，第2、3次间隔4 h；采血时间：第3次给药后2 h无菌条件下心脏采血。静置4 h，3000 r/min离心20 min，分离血清（药物血清，DS），同种条件下药物血清混匀，56 ℃条件下水浴30 min灭活，-20 ℃冰箱保存备用。经培养实验没有微生物生长。
2.3 细胞的培养
BGC823细胞（人胃癌细胞株），由兰州大学细胞室引进。将BGC823细胞用含有青霉素、链霉素各100 U/mL、15 %小牛血清的RPMI1640培养液培养。在5 %CO2、37 ℃培养箱中培养2~3 d后进行传代培养。
2.4 MTT法测定半夏泻心方及配伍药组含药血清对BGC823细胞的敏感性
取对数生长期的BGC832细胞，细胞存活率达95 %以上，先用0.25 %胰蛋白酶消化培养细胞，再用含10 %胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL。在细胞液中加入最终浓度分别为5 %、10 %的全方、辛开、苦降、辛苦、甘补、辛甘、苦甘的兔血清，各浓度设三个平行孔，并设正常兔血清对照组及5-FU阳性对照组，平行做3板，将培养板放入CO2培养箱，在37 ℃、5 %CO2及饱和湿度条件下分别培养24 h、48 h、72 h， 每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37 ℃继续孵育4 h后，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，使甲充分溶解，在490 nm波长下，用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值（A），按下列公式求出细胞存活率。每个样品计数4次，根据3次实验结果求平均值和标准差(x-±s， n=3) 。细胞存活率=试验组光吸收值（A） 对照组光吸收值（A）×100 %x
2.5 台盼兰染色法测定半夏泻心方及配伍药组含药血清对BGC823细胞生长的影响取一瓶对数生长期的细胞，细胞存活率达95 %以上。用含有15 %小牛血清的RPMI1640培养液将细胞数调节为2×105~3×105/mL，接种于96孔塑料培养板中。在细胞液中加入最终浓度分别为20 %、50 %的全方、辛开、苦降、辛苦、甘补、辛甘、苦甘的兔血清。各浓度设三个平行孔，并设正常血清对照组。置37 ℃、5 %CO2培养箱培养24 h、48 h、72 h。取出后，加入4 %台盼兰染液，显微镜下计数存活细胞数。显色为蓝色的为死细胞，未显色的为活细胞，按下列公式求出细胞生长抑制率。每个样品计数3次，根据3次实验结果求平均值和标准差(x-±s ，n=3)。
细胞生长抑制率（%）=对照组活细胞数－实验组活细胞数 对照组活细胞数×100
2.6 统计学方法
各组数据均用（x-±s）表示，用SPSS10.0统计软件进行统计分析。采用方差分析(ANOVA)进行显著性检验，多组间比较采用q检验。
3 结果
3.1 半夏泻心方及配伍药组对BGC823细胞敏感性的影响 表1半夏泻心方及配伍药组含药血清对BGC823细胞敏感性的影响 注：与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与辛苦组比较 △ P<0.05,△△ P<0.01；与全方组比较▲ P<0.05,▲▲ P<0.01 如表1所示：与正常组比较，半夏泻心方及各配伍含药血清对BGC823细胞的细胞存活率都有一定的影响，且各组在48 h最为明显，细胞存活率随着含药血清浓度的上升而表现出显著的剂量―效应关系（P<0.05或P<0.01）；各配伍药组组间比较:辛苦组显著低于辛开组、苦降组、辛甘组、苦甘组、甘补组（P<0.05）；辛开组显著低于苦降组、辛甘组、苦甘组、甘补组（P<0.05）；苦降组显著低于辛甘组、苦甘组、甘补组（P<0.05）。半夏泻心方及各配伍含药血清药效总体表现为辛苦>辛开>苦降>辛甘>苦甘>全方>甘补。
3.2 半夏泻心方及其配伍药组含药血清对BGC823细胞生长的影响 表2半夏泻心方及配伍药组含药血清对BGC823细胞生长的影响如表2所示：与空白组比较，半夏泻心方及各配伍含药血清对BGC823细胞生长都有一定的抑制作用，且各组在48 h最为明显，细胞抑制率随着含药血清浓度的上升而表现出显著的剂量―效应关系（P<0.05或P<0.01）；各配伍药组组间比较：辛苦组显著高于辛开组、苦降组、辛甘组、苦甘组、甘补组（P<0.05）；辛开组显著高于苦降组、辛甘组、苦甘组、甘补组（P<0.05）；苦降组显著高于辛甘组、苦甘组、甘补组（P<0.05）。半夏泻心方及各配伍含药血清药效总体表现为辛苦>辛开>苦降>辛甘>苦甘>全方>甘补。
4 讨论
胃癌属中医痞证、反胃、噎嗝、胃脘痛、症瘕、积聚等范畴。目前中医学对胃癌的发病机制尚没有明确、统一的认识〔5-6〕。通过大样本的临床征候分析，并相关临床资料，我们认为胃癌的中医基本病理机制为脾胃虚弱、寒热阻结、中焦升降失调。即其病机以正虚基础上兼以邪实（寒湿痰浊和热毒）为多见，总体呈现本虚标实的特点。这是胃癌的中医病机关键所在。
分析其原因，可能主要在于饮食不节、寒温不适、恣食生冷、饥饱不匀引起脾胃功能失调, 脾胃虚弱，运化失司，中焦升降失调，致寒湿痰浊阻滞中焦，久郁不去，化生热毒。寒热错杂，阻结中焦,反过来又加重了中焦升降功能的失调，渐而形成症瘕积聚。
半夏泻心方出自《伤寒论》，主治寒热错杂之痞证,为辛开苦降的代表方剂。近年来本方在胃癌的防治中已有一定的临床应用，并取得较好的临床疗效〔2-4〕。本方突出辛开苦降，升降同调，以复中焦之升降。同时兼益气健脾，调理脾胃以扶正，具有寒热并用、温而不燥、寒而不遏之特点。因此，全方由辛开、苦降、甘补3组药组配伍构成，结构严谨，药少力专，十分吻合胃癌的中医主要病机。
目前MTT法常应用于体外肿瘤细胞的药敏实验，获得较好结果，本实验采用MTT实验和台盼兰染色实验观察皆表明辛苦、辛开、苦降组含药血清对BGC823细胞较为敏感，对其增殖有明显的抑制作用，在48 h最为明显，且有显著的剂量―效应关系，但全方和甘补组无明显影响。因此，半夏泻心方中对BGC823细胞增殖起主要抑制作用的药组为辛开、苦降的配伍形式。辛开、苦降配伍后（辛苦）有显著的协同增效趋势。而其他配伍药群（辛甘、苦甘、全方）均较辛苦、辛开、苦降的抑制率低，提示这些配伍形式可能存在拮抗作用。这印证了半夏泻心方作为辛开苦降代表方剂对胃癌细胞增殖抑制作用的配伍内涵，提示辛开苦降法可能是中医药防治胃癌的治则治法之一。这将为进一步研究半夏泻心方抗肿瘤的机制奠定基础。
参考：
〔1〕刘喜平，温志强．半夏泻心方方证及机理研究述评［J］．中医药信息杂志，2000，8（7）：23-25.
〔2〕杨瑞合．半夏泻心汤调治消化道肿瘤三则［J］．陕西中医，1998，（4）：171-172.
〔3〕祝远之，贾崇花．半夏泻心汤脾胃病新用［J］．河北中医，1999，21（5）：239.
〔4〕丰素娟.半夏泻心汤防治胃癌前病变的实验与临床研究［J］.中成药，2000，22（8）：576-577.
〔5〕邓中甲.方剂学［M］．北京：中国中医药出版社，2003：88.
〔6〕李振光，王净净．关于中药血清药方法的思考［J］．中国中医药信息杂志，2002，9（2）：5-6.
