大鼠急性坏死性胰腺炎时P物质在肠壁上的表达及其与肠黏膜通透性的关系
［关键词］ 急性坏死性胰腺炎;神经激肽.1受体;P物质;肠黏膜通透性;大鼠
急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）起病急，病情凶险，当合并胰腺及胰周感染时，病情更加复杂，死亡率明显增加。临床上急性胰腺炎死亡的病人中80%是由胰腺坏死组织继发感染所致。肠源性因素在急性胰腺炎继发感染中的作用和重要性已被认识并确立，因此，探讨ANP时肠黏膜通透性的发生机制对防治胰腺感染有重要意义。
急性胰腺炎时，炎症介质的产生和释放以及炎症细胞的聚集在病程中起重要作用。目前明确的前炎症或促炎症细胞因子较多，其中P物质及其受体―――神经激肽.1受体（NK.1R）近年来受到高度重视［1］ 。但P物质在ANP回肠组织中的表达尚不清楚，P物质与肠黏膜通透性之间的关系也未阐明。本实验通过制作ANP大鼠模型，应用免疫组织化学法研究ANP时P物质在回肠中的表达和组织学定位，进而探讨P物质与肠黏膜通透性之间的关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
健康成年SD大鼠80只，体重250～280g，雌雄各半，由东南大学医学院实验动物中心提供，随机分为对照组和ANP组各40只。
1.2 主要试剂及配制
浓缩型兔抗大鼠P物质抗血清、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），血清淀粉酶（AMS）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），牛磺胆酸钠（Sigma公司），亚锡喷替酸（DT-PA）（原子能研究院同位素所），锝（99m Tc）（中国核动力研究设计院第一研究所）。称取牛磺胆酸钠2g溶入40ml生理盐水（NS）中，制成5%牛磺胆酸钠溶液，在超净台内用过滤器（滤孔为0.22nm）过滤溶液除菌，分装于2只无菌瓶中，常温避光保存备用。
99m Tc.DTPA制备:用灭菌NS淋洗钼.锝发生器获得99m Tc淋洗液，放射活度仪测定其放射活度，灭菌NS将其稀释成放射活度为100μCi・ml-1 ，DTPA标记。
1.3 实验方法及步骤
1.3.1 模型制作
实验前大鼠禁食12～16h，自由饮水。大鼠称重，3%戊巴比妥钠0.1ml・（100g）-1 腹腔注射麻醉。妥善固定大鼠，切开腹壁进入腹腔。近肝门处用无损伤小动脉夹夹闭胆总管，于胆胰管入十二指肠处对侧缘，用连接微量注射泵的4.5号针头斜行刺入十二指肠壁，并进入胰管0.3cm处，以恒定速度（0.1ml・min-1 ）注入5%牛磺胆酸钠［0.1ml・（100g）
-1 ］。并于近端空肠内缓慢注入100μCi99m Tc-DTPA。关腹后向大鼠背部皮下注入NS4～6ml。
对照组仅将十二指肠提出切口，轻轻翻动胰腺3次，而不注射牛磺胆酸钠。
1.3.2 标本采取
距原切口1.0cm切开腹壁，观察腹腔内大体病变情况。
无菌抽取下腔静脉血2～3ml，放入离心管中以3000r・min-1 离心10min，取上清行血清淀粉酶测定（碘.淀粉比色法）。切取2cm长末段回肠，用10%甲醛固定，4℃保存，并收集大鼠8、12、16和20h尿液。
1.3.3 肠黏膜通透性的检测
选用分子直径11nm的99m Tc-DTPA为探针，测定尿液中同位素脉冲数，以间接反映肠黏膜通透性。
99m Tc.DTPA为水溶性，无毒，在体内不代谢，通过尿液测定，具有敏感、准确、简单的优点。公式:肠黏膜通透性（%）=99m Tc.DTPA排泄率（%）=（尿液测定值-本底测定值）×总尿量药物测定值-本底测定值 ×100%。
于近端空肠内缓慢注入100μCi99m Tc.DTPA后放入代谢笼，留取大鼠8、12、16和20h尿液，用放射免疫γ计数器测定尿液中99m Tc.DTPA脉冲数。
1.3.4 回肠组织P物质蛋白表达及组织学定位
应用免疫组织化学法分别检测对照组和ANP组回肠组织的P物质表达水平。
操作步骤:石蜡切片脱蜡到水，用3%H2 O2 灭活内源性酶，滴加1∶100稀释的兔抗大鼠多克隆抗体50μl，置室温下1h，PBS漂洗后滴加1∶100稀释的生物素化山羊抗兔IgG50μl，置室温下30min，PBS洗5min×2次，再滴加1∶100稀释的SABC50μl，用DAB显色，自来水冲洗终止反应。苏木素轻度复染，自来水冲洗，二甲苯透明，封片。染色阳性呈棕褐色。阴性对照组仅滴加正常山羊血清（其中不含一抗）以排除假阳性，其余步骤同前。
显微图像分析:使用四川大学图像图形研究所研制的BioMas图像处理系统随机采集图像，自动得出阳性染色区的面积并除以视场面积，即染色面积比。 1.4 统计学处理
用SPSS软件对数据进行统计学分析，计量资料采用t检验，各组数据以ˉx±s表示，用Spearman相关性分析法进行结果之间相关性分析，P<0.05被认为两组间有显著差异。
2 结 果
2.1 淀粉酶测定值和病理形态学观察
ANP组血清淀粉酶值在相应时间点均显著高于对照组（P<0.05），且随时间推移，其测定值逐渐增加（表1）。开腹后肉眼观察，ANP组大鼠腹腔内可见较多血性腹水，肠系膜、大网膜出现皂化斑，胰腺可见充 血水肿、出血坏死灶及皂化斑，病变以胰头、体部为重，结肠及小肠管壁充血水肿，小肠色泽暗红，肠蠕动明显减少，弹力减弱;对照组大鼠腹腔内无腹水，胰腺和肠管未见明显异常改变。表1 两组大鼠成模后各时间点血清淀粉酶测定值（略）
2.2 ANP时肠黏膜通透性的改变
与对照组比较，ANP组在成模后8h肠黏膜通透性即有升高，而且随时间延长，肠黏膜通透性也逐渐增高（P<0.05）。两组大鼠肠黏膜通透性的检测结果见表2。表2 各组大鼠成模后各时间点肠黏膜通透性的比较（略）
2.3 肠组织中P物质表达水平及组织学定位
对照组大鼠回肠组织中P物质表达主要位于黏膜上皮细胞表面、腺细胞、神经和神经节;ANP组的染色区域增加，除以上阳性表达部位增强外，还可见于小肠黏膜间质中大量浸润的炎症细胞、淋巴细胞、血管壁（尤其是血管内皮细胞）以及部分成纤维细胞（图1）。各组大鼠回肠组织阳性染色面积比见图2。
2.4 ANP时回肠P物质表达与肠黏膜通透性的关系
将应用免疫组织化学法测定的P物质表达水平与肠黏膜通透性作相关性分析，结果发现，回肠P物质表达水平与肠黏膜通透性明显相关（r=0.66，P<0.01，图3）。
3 讨 论
ANP是外科常见的急腹症之一，病情凶险，当并发胰腺及胰周感染时，死亡率达20%～40%。现已证实，胰腺感染主要是移位的肠道细菌和内毒素所致的肠源性感染，肠源性因素在急性胰腺炎继发感染中的作用和重要性已被认识并确立。了解肠黏膜通透性改变的机制对防治胰腺感染有重要的理论意义和实用价值。
Mardara［2］ 研究发现，细菌移位的发生与肠道屏障功能正常与否密切相关，而肠黏膜通透性可以较好地反映肠道的屏障功能和组织结构［3］ 。因此，本实验通过测量肠黏膜通透性来反映肠道屏障功能，并间接反映细菌移位的发生情况。实验显示，肠黏膜通透性在ANP早期即有升高，且随时间延长而加重，从而提示细菌在ANP早期就可通过受损的肠黏膜屏障发生移位，加重ANP病程。
P物质是一种神经炎性递质，由11个氨基酸组成，它广泛分布于哺乳动物中枢和周围神经系统以及外周组织中。它在哮喘、炎性肠病、关节炎、支气管炎等炎症过程以及帕金森病、心血管系统中起重要的作用［4，5］ 。近年来研究发现，P物质及其受体在急性胰腺炎的发生中起到了重要作用［6～9］ 。P物质不仅直接参与ANP的发生，而且关系到ANP病情的严重性以及预后。本实验应用免疫组织化学法测定ANP大鼠肠壁上P物质的表达，发现在ANP成模8h后肠壁阳性染色面积明显增加，除黏膜上皮细胞表面和小肠腺细胞外，还可见于大量浸润的炎症细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞以及成纤维细胞。统计结果显示，P物质表达在ANP组和对照组比较差异明显，且随时间延长，P物质的表达有上升趋势。同时，在相应时间点测量肠壁通透性时发现，ANP时肠壁通透性较对照组明显升高，应用Spearmann相关性分析法对结果进行相关性分析表明，P物质的表达与肠黏膜通透性呈正相关。作者以往的研究证实［10］ ，在ANP大鼠肠壁中NK-1R的表达明显升高，提示P物质通过与表达增加的相应受体结合介导炎症反应，加重肠壁病理损伤，引起肠黏膜通透性增高。既往研究认为［11～15］ ，P物质可刺激γ.干扰素（γ.IFN），肿瘤坏死因子α（α.IFN），白细胞介素.12（IL.12）以及黏附分子、IL.1和IL.6的释放，后者可进一步活化中性粒细胞，并促进炎症介质和细胞因子的瀑布样释放，加剧各组织器官的病理损伤。结合本次实验结果提示，P物质的过度表达可与表达增加 的相应受体结合，并与肠壁上的炎症细胞、淋巴细胞以及血管内皮细胞交互作用，共同导致肠黏膜通透性的升高，损害肠黏膜屏障功能，促进细菌移位，增加肠源性胰腺感染的发生。
［］
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