兔下颌角截骨后咬肌肌球蛋白重链mRNA表达的变化
［关键词］ 下颌角截骨;咬肌;肌球蛋白重链;兔
面部形态是软组织及骨组织相互作用和影响的最终产物，这种互动作用在面部轮廓形态中具有重要意义。最富有变化且体现个性特征的是面中、下1.3，下颌骨和咬肌对于面下部形态起着重要作用。按照东方人的审美观，以椭圆形或“瓜子脸”为美，因此，下颌角截骨方腮畸形的措施是目前颅颌面外科常行的美容手术之一。我们用兔模拟临床下颌角截骨，通过对咬肌肌球蛋白重链的两个亚型，即肌球蛋白重链（myo-sin heavy chain，MHC）Ⅰ、Ⅱ型mRNA表达量的测定，研究咬肌的改建能力及功能的恢复特点，为临床下颌骨架改变手术提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
雌性3月龄新西兰大白兔25只（东南大学医学院实验动物中心提供），体重220～270g。左侧下颌角截骨，为手术侧，右侧为非手术侧，设为对照。以0.6%戊巴比妥钠静脉注射麻醉。于左侧下颌角处作一长2～3cm切口，沿骨面分离咬肌和翼内肌附着部至下颌角前后切迹连线，以前后切迹沟连线作垂线与下颌角形成交点，该交点沿垂线上0.5cm取一定点，以前后切迹点和定点作一条弧线，用磨钻沿弧线打孔定位后截骨。肌肉放置原位，缝合切口。术后3d用抗生素预防感染。分别于术后2、4、8、12和24周处死5只动物，于定点处取部分咬肌，大小0.8cm×0.5cm×0.5cm，迅速放入-70℃冷冻保存。
1.2 RNA的提取与RT.PCR
（1）总RNA的提取:采用Trizol一步法提取组织的总mRNA。（2）总RNA反转录为cDNA:根据Revertaid TM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书，以总mRNA为模板合成相应的互补cDNA。反应体系为20μl，反应条件为70℃变性5min，42℃反转录1h，最后70℃5min灭活反转录酶。（3）PCR:在同一管中扩增MHCⅠ、MHCⅡ及GAPDH mRNA的cDNA产物，反应体系为50μl，反应条件为94℃预变性5min，95℃变性40s，59℃退火1min，72℃延伸2min，共循环29次，最后72℃再延伸10min。（4）本实验所用的PCR引物为MHCⅠ上游5′.GGATCCCTGGAGCAGGAGAA.3′、下游5′.CTTG-CATTGAGGGCATTCAG.3′，大小173bp;MHCⅡ上游5′.CCCTAAAGCGGGAGAATAAG.3′、下游5′.GCTCTG-CATCGACTCTACCAC.3′，大小307bp;GAPDH上游5′.GATCCATTCATTGACCTCCACTA.3′、下游5′.CACCACCT-TCTTGATGTCGTC.3′，大小703bp。
1.3 MHC mRNA转录量分析
各组分别取8μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。对经EB染色后的目的条带和内参条带进行摄像，应用Imagemaster图像分析仪进行扫描，Total Lab图像分析软件分析图谱，目的MHC的相对含量。目的mRNA的相对含量:某mRNA水平相对值=目的条带光密度值.内参GAPDH条带光密度值。
2 结 果
2.1 PCR产物的凝胶电泳 见图1。PCR产物经凝胶电泳鉴定，扩增片断特图1 不同时间MHCⅠ、MHCⅡ和GAPDH的电泳条带
2.2 统计结果
见表1。术后2周左侧咬肌MHCⅠ和MHCⅡ的mRNA表达量较右侧显著下降，4周后MHCⅡ的mRNA左、右侧咬肌无显著性差异。12周后MHCⅠ的mRNA表达量双侧无显著性差异，MHCⅡ.MHCⅠ之值2、4、8周左侧高于右侧，双侧有显著性差异。
2.3 检测指标与统计学处理
根据原始数据分别各组MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡ.MHCⅠmRNA含量的相对值，其中MHCⅠ与MHCⅡ分别代表各自的mRNA水平，MHCⅠ.MHCⅡ之值代表了两种亚型之间的比例关系。
全部数据均采用统计学软件SPSS11.0进行统计学分析，手术侧和非手术侧的比较采用t检验。 表1 非截骨侧和截骨侧咬肌MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡ.MHCⅠmRNA含量的相对值（略）
3 讨 论
面部改形手术主要通过骨架的延长或缩短，从而达到矫正畸形、美化面容的效果，功能和外形是手术必须兼顾的两方面。人体的正常形态结构和生理机能是密切相关的，口腔颌面系统作为一个功能整体，其中任何一部分出现形态的变化都可能会导致机能的改变。在下颌角弧形截骨术中需要去除部分骨质，在下颌角附着的咬肌、翼内肌下部进行剥离，其末端附着也随着骨质的去除而上移。由于术后肌肉的张力发生变化，故在其附着重建的同时，咬肌会自发地发生相应的萎缩，从而变薄变短［1］ 。肌力对咬合功能的影响、肌肉萎缩与骨架缩短匹配的程度，这些都是方腮畸形行下颌角截骨手术应考虑的。
根据肌纤维所含MHC亚型的不同主要分为慢肌纤维（MHCⅠ）与快肌纤维（MHCⅡ）两种2］ ，Ⅰ型纤维氧化酶活力高，磷酸化酶和ATP酶活力低，收缩慢，耐疲劳，Ⅱ型与之相反。不同动物与不同部位肌肉中各亚型比例是不同的。肌肉中所含的肌纤维亚型不同，它们的收缩和代谢特性也不同。肌纤维的类型主要由遗传决定，但是肌肉组织的生物可塑性很强，一些外部环境因素如功能负荷、神经支配、激素和慢性电刺激等均可通过调节其基因表达而改变其亚型比例，以适应功能变化的需要［3，4］ 。在这个变化过程中，较之于蛋白质的合成增加或减少，其
本实验研究显示，在兔下颌截骨后2周咬肌MHCⅠ和MHCⅡmRNA表达降低，说明骨架缩短早期咬肌的功能下降。4周后MHCⅡmRNA的表达量恢复正常，快肌主要参与位移变化，而慢肌纤维主要参与维持体位，在咀嚼功能中快肌起主导作用，优先得以恢复。MHCⅡ.MHCⅠ之值前8周术侧较对侧升高，而肌肉大体形态术侧表现为萎缩。这个过程中MHCⅠmRNA的表达下调，可能发生了Ⅰ型纤维向Ⅱ型纤维转化。这与Song等［1］ 的ATP酶染色结果一致，同时Lambert5］ 发现，肥大的嚼肌标本Ⅰ型肌纤维明显增加，Ⅱ型肌纤维则明显减少。临床下颌角肥大的病人往往伴有咬肌肥大，本实验缩短下颌骨架咬肌发生萎缩，出现了与Lambert研究咬肌肥大病人肌纤维组成相反的变化结果。由此可见，MHCⅠ表达的下降与MHCⅡ表达的变化不是一个简单的对等关系，而是肌肉组织根据功能的需要调节各个亚型基因表达的结果。
总之，骨骼肌是一种动态的多样化的组织，肌纤维类型和肌纤维蛋白同功型的多种多样可适应不同的功能要求。在兔下颌截骨后咬肌发生了肌纤维亚型表达的改变，表明下颌骨架缩短后发生了慢肌向快肌转化，快肌的功能优先恢复，这种变化有利于建立一个新的口颌系统平衡，满足咀嚼功能的需要。
［］
［1］SONG H S，PARK C G.Masseter muscle atrophy after ostectomy of the mandibular angle in rabbits［J］.Plast Reconstr Surg，1997，99（1）:51.59.
［2］ALBIS A，JANMOT C，BECHET J J.Comparison of myosins from the masseter muscle of adult rat，mouse and guinea-pig persistence of neonatal-type isoforms in murine muscle［J］.Eur J Biochem，1986，156（2）:291.296.
［3］GOLDSPINK G，SCUTT A，LOUGHNA P T，et al.Gene expression in skeletal muscle in response to stretch and force gene ration［J］.A J Physiol，1992，262:356.363.
［4］READER M，SCHWARTZ G，ENGLISH A W.Brief exposure to testosterone is sufficient to induce sex differences in rabbit masseter muscle［J］.Cells Tiss Org，2001，169:210.217.
［5］LAMBERT C D.Hypertrophy of branchial muscles［J］.J NeurolNeurosurg Psy，1976，39:810.817.
