外治法对实验性兔膝骨性关节炎滑膜中bFGF表达的影响
关键词：骨性关节炎；外治法；碱性成纤维细胞生长因子；滑膜
骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种慢性关节病，又称退行性关节病、增生性关节病等。其特征是关节软骨发生原发性或继发性退行性变，并在关节边缘有骨赘形成。本病的病理变化以关节软骨变性及软骨下骨质病变为主。中医外治法治疗OA有显著疗效[1-2]。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能够诱导外胚层和中胚层来源的细胞增殖和分化，具有强大的促有丝分裂的作用，且在软骨损伤后的修复中有很重要的作用。本实验通过检测bFGF在兔关节滑膜中的表达及分布，试图探讨中医外治法治疗OA的机理。
1 材料
1.1 实验动物
健康雄性新西兰大耳白兔32只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，质量2.1～2.5 kg。
1.2 实验试剂及仪器
bFGF一抗、SABC试剂盒、DAB显色盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；扶他林乳胶剂购自湖北省中医。熏洗中药购自湖北武汉定康大药房，方剂采用湖北省中医医院成方伤科熏洗汤。中药组成：羌活12 g、独活12 g、桂枝10 g、桑枝30 g、伸筋草10 g、透骨草10 g、花椒10 g、艾叶10 g、五加皮12 g、海桐皮12 g、白芷10 g、防风10 g。G6805-1型针灸治疗仪为青岛鑫升实业有限公司生产，湖北中医学院针灸实验中心提供。
2 方法
2.1 造模方法
以结扎股静脉的方法[3]造模，用0.3 %的戊巴比妥按3 mg/kg剂量进行耳缘静脉麻醉。麻醉满意后将家兔仰卧固定于兔台上，四肢伸直。所有实验动物均取右侧下肢造模。右侧股根部备皮、消毒，无菌条件下操作，用手指触及腹股沟股动脉搏动处并以此为中心，做2 cm纵行切口，切开皮肤、皮下组织，暴露股神经血管束，分离股静脉并进行双重结扎，在两道结扎线间将股静脉剪断，缝合皮肤及皮下组织。术后每天肌注青霉素20万U/只，共7 d，以预防感染。
2.2 分组及处理
32只白兔随机分为正常组、模型组、扶他林组和外治法组，每组8只。正常组不做任何特殊处理。模型组造模成功后正常喂养，自由活动。扶他林组用扶他林乳胶剂在患膝周围涂抹均匀，轻揉3~5 min。外治法组则用中药熏蒸配合手法弹拨以及电刺激，每次熏蒸30 min，手法弹拨20 min，以膝关节周围及股后侧及小腿后侧肌肉为主，配合伸膝关节。电刺激采用G6805-1型针灸治疗仪，配用自制电极，主要刺激兔股前侧及小腿后侧肌肉及膝周穴位，引起兔患膝被动屈伸达40°～50°为宜，主要以屈曲为主。以上两组均造模成功、自由喂养8周后分别开始治疗。治疗4周后处死动物取标本，标本取出后用10 %多聚甲醛固定，行石蜡切片。模型组和正常组均在相应时间处死，取标本做石蜡切片。
2.3 检测方法
石蜡切片常规脱蜡，3 %的双氧水室温5～10 min灭活内源性酶。抗原热修复。滴加5 % BSA封闭液，20 min(室温下)。加入稀释的bFGF一抗，1 h(37 ℃)。加入生物素标记的羊抗兔二抗，链霉亲合素生物素过氧化酶溶液与DAB液，室温显色，镜下控制反应时间。苏木素复染封片观察。其间每个步骤均用PBS冲洗5 min 3次。结果判定：在400倍高倍镜下观察细胞内外有无染色，未着色为阴性，浅棕黄色为弱阳性，中等棕黄色为阳性，深棕黄色为强阳性。
2.4 统计方法
实验数据以平均值±标准差(±ｓ)表示，组间差异比较采用q检验，所有数据均采用SPSS 11.0统计软件进行分析。
3 结果
正常组免疫组化染色为阴性；模型组仅有部分细胞因子反应阳性，部分为弱阳性，胞浆中有黄褐色的斑块状阳性物质分布，但量较少，大部分细胞无着色，外治法组和扶他林组与正常组相比有所不同，胞浆中阳性物质数量增多，阳性细胞增加。在400倍光镜下每组选取10个典型视野，采用同济医科大学免疫组化实验室HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统进行分析。具体结果见表1。
表1 各组bFGF平均光度均值的比较(略)
注:与外治法组比较*P＜0.05，**P＜0.01
4 讨论
bFGF最早由牛的脑垂体中提取，是由146个氨基酸组成的活性物质，它对中胚层来源的细胞有明显的促有丝分裂作用[4]。它的生物学功能有以下几个方面：促进新生血管形成;促进软组织损伤修复;促进骨、软骨组织损伤修复。现已证实在人体和动物实验中bFGF关节内注射对软骨细胞的再生修复有很好的促进作用[5]。实验研究表明bFGF对体外培养的兔软骨细胞促进胶原合成和维持软骨细胞表型有重要作用[6]。并认为可能与以下作用有关： 增加细胞汇合生长时细胞的量；增加软骨细胞蛋白多糖和胶原合成，可使高分子蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量增高；可阻滞软骨细胞的分化；可使衰老或退变的软骨细胞反分化而使其表型接近正常细胞。徐卫东等[7]通过观察bFGF对培养兔关节软骨细胞基质及转化生长因子β1(TGFβ1)表达的影响，结果发现bFGF能明显促进胶原和蛋白多糖的合成，并与剂量、时间成正相关，能促进关节软骨TGFβ1的表达，从而推迟了关节软骨细胞的成熟，维持细胞的软骨表现型。
本实验中采用股静脉结扎的造模方法，比较接近OA早期的病理改变。OA在中医属“痹证”范畴。通过结扎股静脉造成下肢血液回流受阻，与其他的造模方法相比，保留膝关节功能与正常结构，更符合该病的临床发病。
实验结果表明：外治法组关节滑膜中bFGF的表达明显强于扶他林组，可能与以下因素有关：（1）熏洗中药主要具有活血化瘀、祛风胜湿、温通经络的作用，通过熏洗的热效应和药物作用可以使淤滞的气血得以温通，改善了局部的微循环条件。其中羌活、独活、五加皮、海桐皮、伸筋草、透骨草等祛风湿类中药有明显的抗炎、镇痛作用[8]。（2）通过电刺激以及手法后，可以促进静脉回流，可能对bFGF的表达也有影响。
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