干细胞移植治疗心肌梗死的MR分子影像学示踪

                              作者：祁春梅，马根山，刘乃丰

【关键词】  干细胞； 移植； 心肌梗死； 磁共振成像； 分子影像学； 综述

    近年来，冠心病的研究进展很快，尤其是干细胞移植治疗心肌梗死(心梗)的实验及临床研究均取得了令人瞩目的进展，骨髓干细胞移植已成为治疗冠心病的热点之一，但干细胞移植仍有许多亟待解决的问题，其中突出的问题是无法在体示踪、识别移植后的干细胞，客观评价其疗效。分子影像学是目前可以在活体状态下在细胞和分子水平对生物过程进行定性和定量研究的新型交叉学科［1］。磁共振 (magnetic resonance，MR)分子影像学可将移植的细胞进行磁性对比剂标记，通过磁共振成像(magnetic resonance image,MR)对其进行可视化追踪，就可得知移植细胞在体内的运动信息及未来命运。MR分子影像技术由于其独特的优势，在干细胞移植研究中具有巨大的潜力。

    1  心肌干细胞移植现状

    1.1  移植细胞类型的合理选择

    目前用于临床移植的骨髓干细胞大体分为骨髓单个核细胞群(bone marrow mononuclear cells,BM- MNCs)、骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）、造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）、内皮祖细胞（endothelial prognitor cells,EPCs）和ACC133+细胞5种。近期，Fraser等［2］研究认为脂肪干细胞（ADSCs）也具有自我更新能力和多分化潜能，从而分化为心肌细胞，改善心功能，这为干细胞移植治疗心梗提供了另一个选择。2005年，Katritsis等［3］于冠脉内同时植入MSCs及EPCs，证实植入两种细胞的方法亦可有效再生梗死心肌。临床上由于移植细胞成分的复杂，各类细胞各有利弊［4］：BM- MNCs 成分丰富，无需体外扩增和诱导分化,但细胞分化鉴定困难；MSCs 取材方便，成本低，增殖能力强，具多向分化潜能，但需要体外扩增、诱导及分化；HSCs具有高度的自我更新和分化能力，但是细胞数量少、分离成本高；EPCs 为单一细胞群，具有增殖能力高、多能性、可自体移植特点，但细胞数量少，需要扩增；ADSCs取材方便，来源充足，但动物试验及临床验证较少。到底哪类细胞移植更有利于心脏功能恢复，骨髓干细胞的哪些组分或组分混合物最适于移植，目前动物及临床试验较少。

    1.2  骨髓干细胞移植途径与时间窗选择

    目前干细胞移植途径主要包括经心梗相关血管注射、心梗区局部注射和经静脉注射。2006年Freyman等［5］定量、随机比较了此3种途径治疗心梗的疗效，结果显示，心肌内及冠脉内注射MSCs较静脉注射能更有效地改善心功能，而冠脉内注射又优于心肌内注射途径，认为这种经冠脉内注射移植细胞的方法，由于其微创及靶向输送而可成为细胞移植治疗心梗的一种有前途的手段。

    以往的临床研究大多在心梗后1～2周进行干细胞移植。近来Askari等［6］研究发现,急性心梗后梗死区域中具有诱导干细胞归巢作用的基质细胞起源因子1（stromal-cell-derived factor 1,SDF-1）的表达立即上调，但7 d内SDF-1表达就下降，因此认为应在急性心梗后1周内尽早进行细胞移植。2006年，Wang等［7］对20例PCI术后患者及15例冠脉正常患者进行比较，观察术后1、 3、 7、14、 21和28 d干细胞归巢因子、血管生长因子的变化，认为干细胞治疗的最佳时机为心梗后7至28 d。鉴于各研究结果不同，因此有必要寻求一个合适的时间窗，既可以完成干细胞制备，又不至于晚到影响移植的效果，使机体获益最大。

    1.3  骨髓干细胞移植临床应用及疗效

    2006年Boyle等［8］小结了干细胞移植的临床应用情况，结果，许多临床实验［9-11］表明骨髓干细胞移植具有明显的疗效，使梗死区组织灌注增加，心脏射血分数提高，梗死面积缩小。且众多实验证明，BM- MNCs、外周血单个核细胞和MSCs移植后，心肌安全性良好，未发生与移植有关的心血管不良事件。也有报道发现有发生支架内再狭窄和增加血管钙化的可能。

    1.4  亟待解决的问题

    (1)哪种细胞更适合心肌细胞再生及血管化，哪种细胞更适合心梗治疗；（2）心肌再生的最佳细胞移植数量；(3)移植的最佳时间；（4）最有效的移植方法和部位；（5）增加的心肌灌注是否可以改善心功能；（6）再生细胞与自体细胞相互作用和融合的局部最佳环境；（7）移 植的效果能持续多久，如何提高移植细胞的存活率；（8）如何标记和示踪移植细胞；（9）发现控制干细胞归巢的分子信号；（10）如何监测临床试验中可能发生的副作用和疗效评价［12］。

    以上研究结果表明，对干细胞移植诸多方面的评价，有待于扩大样本量，成立骨髓干细胞临床应用研究协作组，开展多中心、大样本、随机双盲对照研究，同时结合更先进的影像检查技术才能作出最后评定。

    2  MR分子影像学

    1999年，美国哈佛大学Weissleder等［1］提出分子影像学概念，分子影像学即分子水平的医学成像。分子影像技术可以在分子水平实现生物有机体生理、病理变化的实时、在体、特异性成像。传统的影像诊断显示的是分子改变的终效应,即病理或解剖结构的改变，分子影像学则偏重于疾病的基础变化、基因分子水平的异常,在特异的分子探针的帮助下，分子影像技术可将基因表达、生物信号传递等复杂的过程变成直观的图像,使人们能更好地在分子水平上了解疾病的发生机制及特征，不仅可以提高临床诊治疾病的水平,更重要的是有望在分子水平发现疾病,真正达到早期诊断。

    目前应用于分子影像学的技术主要有核医学、MR、光学成像（opticalimaging)3种。MRI在分子影像学应用中具有其他影像学技术不可比拟的优越性，MR分子成像的突出优点在于它的高分辨率，因无电离辐射、高的空间分辨力及软组织分辨力、可进行多次连续成像而更有可能应用于临床试验中。MR分子成像与传统MRI技术的重要区别在于将传统的非特异性物理成像转变为特异性分子成像,它的评价指标不同于传统的MRI指标，MRI不仅具有优良的空间和时间分辨率，而且还能得到血流量、局部和整体心功能以及心肌灌注和心肌代谢等组织学信息，对深部组织的分子影像学特征进行精细、准确的定位、定量分析，在细胞分子水平的功能成像将具有独特的地位和作用，是最理想的分子影像学分析技术之一，因此成为目前心肌干细胞移植疗效评价的首选方法［13］。

    3  干细胞的标记及MR示踪

    干细胞移植后，如何观察移植细胞的迁徙、分化以及从受体辨别供体细胞，一直是困扰人们的问题。目前有多种影像学方法被用于追踪评价干细胞移植后心脏结构功能的改变,主要包括超声、CT、单光子发射型机体层摄影术(SPECT)、PET以及MRI等。相比之下，MRI不仅拥有优良的空间与时间分辨率,其“一站式”扫描能够涵盖包括形态、结构、功能以及分子和基因显像等，尤其是移植磁性对比剂标记的细胞,可达到替代病变细胞而具有治疗作用的目的，同时可解决移植细胞在活体内被MR示踪的一个难题［14］。MR分子影像学标记及示踪在干细胞研究与应用中发挥着极其重要的作用。

    MRI检测移植干细胞的研究主要集中在对比剂方面［15］，因为单纯利用细胞自身的结构特征很难产生理想的MRI对比效应。目前标记干细胞的MRI对比剂主要分为两大类：一类是以钆(Gd3+)为基础的对比剂,主要产生T1正性对比效应，但Gd- DTPA体内消除太快，而且体内分布没有特异性，使MR图像对比不能明显改善，同时也需要响应的设备能够快速扫描，其价格也较贵，目前有关的应用报道不多；另一类是以氧化铁为基础的对比剂,如超顺磁性氧化铁颗粒(superparamagnetic iron oxide,SPIO),或超小超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)［16］,或单晶氧化铁纳米复合物(monocrystalline iron oxide nanocompound,MION)都能够被干细胞吞噬,因此可被用于追踪探测微量的干细胞，其特点是产生较强的T2负性对比效应，大大提高了MRI的敏感性，克服了MR固有的缺点，且具有生物可降解性，能被细胞代谢后进入正常血浆铁池，与红细胞血红蛋白结合或用于其他代谢过程，其表面包被物可以直接与功能集团和配体进行化学结合，易于用光镜和电镜显示［17］。以上特点使氧化铁类对比剂更受关注，是目前较理想的MR靶向对比剂。SPIO不能单独有效地标记非巨噬细胞,近年来,随着分子影像学的，国内外对SPIO进行了广泛而深入的研究，采取一些特异方法有效标记需要移植的细胞。

    国外已有一些动物实验证实，MRI可有效在体示踪SPIO标记的心肌干细胞。其动物实验多采用MRI引导下梗死心肌局部注射的方法来示踪标记细胞。Dick等［18］使用铁荧光颗粒（IFP）与骨髓干细胞共同孵育18～24 h后也获得成功标记的MSCs，利用1.5 T 场强的MRI系统先在心梗部位确定注射靶位，然后使用MR兼容的导管将IFP标记的MSCs准确、安全地在心肌靶位处注射并实时显像证实注射成功，并可追踪标记细胞的潜在疗效。Kraitchman等［19］应用Feridex及荧光染色剂与MSCs共同孵育24～48 h后，将标记的400×106个细胞局部注射至猪梗死心肌区，系列MR检查示注入细胞的低回声区逐渐变弱，病理检查发现低回声区普鲁士蓝染色阳性，证实MRI可有效检测MSCs的定位及迁徙；Hill等［20］利用IFP作为体内MR的示踪剂来标记MSCs，体外培养证实标记细胞保持活性并且标记可保持达3个月之久，并利用连续的MRI技术进行在体动物实验，证实在跳动的心脏中，MRI可准确地追踪到移植在正常及梗死心肌处的被标记的MSCs，病理荧光检查证实了相应部位标记细胞的存在。2005年Bulte等［21］应用Feridex标记的MSCs，采用MRI观察其对梗死杂种犬心肌的分化能力，心肌内注射（30～150）×106个MSCs，证实了MR导向细胞移植在移植后8周仍可示踪到MSCs，并证实了Feridex标记人、犬及猪的MSCs有效性。2003年，Baklanov等［22］经冠脉窦及冠脉途径注入Feriedex标记及未标记的BM-MNCs，然后行Gd- DTPA增强扫描，结果显示，Feriedex标记的细胞在梗死区周边细胞聚集处呈模糊的低信号区，增强后可见细胞聚集区呈现较增强前清晰的低回声信号，而未标记细胞组未出现低回声区，仅表现为梗死区心肌变薄，证实可利用MR技术及Gd- DTPA增强在心梗区追踪有磁性标记的MSCs。

    尽管利用MR分子影像学示踪标记细胞，被认为是目前研究心梗干细胞移植的首选方法［13］，但我们还应该看到,MR分子影像学的研究仅处于初步阶段,还没有形成规模，目前国内在这一领域研究进行较少,还有众多的问题需要解决。目前应用的对比剂因其本身的伪影，难以精确定量检测干细胞及移植细胞数量；如何消除金属移植物产生的伪影，如何保证检查的安全性成为一个难题；就MR本身而言，实现更有效的MR引导下的心肌内干细胞注射，也需要设备的进一步。但在心肌干细胞移植领域,心脏MR已经成为不可缺少的部分,并且毫无疑问将会得到更广泛的应用与发展［23］。

【】
  ［1］WEISSLEDER R，MAHMOOD U.Molecular imaging（Review）［J］. Radiology，2001，21（2）：316- 333.

［2］FRASER J K,SCHREIBER R,STREM B,et al.Plasticity of human adipose stem cells toward endothelial cells and cardiomyocytes［J］.Nat Clin Pract Card Med，2006，3(Suppl 1)：S33- S37.

［3］KATRITSIS D G，SOTRIOPOULOU P A，KARVOUNI E，et al.Transcoronary transplantation of autologous mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into infarcted human myocardium［J］.Catheter Cardiovasc Interv，2005，65(3)：321- 329.

［4］KEIICHI F,SHINSUKE Y.Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes［J］.Circ Res，2006，98(8):1002-1013.

［5］FREYMAN T，POLIN G，OSMAN H，et al.A quantitative，randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction［J］.Eur Heart J,2006，27(9):1114-1122.

［6］ASKARI A T，UNZEK S，POPOVIC Z B，et al.Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy［J］.Lancet，2003，362 (9385):697- 703.

［7］WANG Y,JOHNSEN H E,MORTENSENO S，et al.Changes in circulating mesenchymal stem cells，stem cell homing factor，and vascular growth factors in patients with acute ST elevation myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention［J］.Heart，2006，92(6)：768 - 774.

［8］BOYLE A J，SCHULMAN S P，HARE J M.Stem cell therapy for cardiac repair：ready for the next step［J］.Circulation，2006,114(6)：339- 352.

［9］STRAUER B E，BREHM M，ZEUS T，et al.Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans［J］.Circulation，2002,106(15):1913-1918.

［10］ASSMUS B，SCHACHINGER V，TEUPE C，et al.Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction(TOPCARE-AMI)［J］.Circulation，2002,106(24):3009- 3017.

［11］SCHACHINGER V，ASSMUS B，BRITTEN M B，et al.Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction：final one-year results of the TOPCARE- AMI Trial［J］.J Am Coll Cardiol，2004,44(8):1690-1699.

［12］RUCHAN A,SERKAN D，TUMER C,et al.Regenerative medicine for cardiovascular disorders-new milestones：adult stem cells［J］.Artif Organs，2006，30(4)：213- 232.

［13］BULTE J W，DOUGLAS T，WITWER B，et al.Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells［J］.Nat Biotechnol，2001,19(12)：1141-1147.

［14］PENNELL D J，SECHTEM U P，HIGGINS C B，et al.Clinical indications for cardiovascularmagnetic resonance(CMR)：consensus panel report［J］.Eur Heart J，2004,25(21)：1940-1965.

［15］JAFFER F A，WEISSLEDER R.Seeing within：molecular imaging of the cardiovascular［J］.Circ Res，2004，94(4)：433- 445.

［16］RUDIN M，RAUSCH M，STOECKLI M.Molecular imaging in drug discovery and development：potential and limitations of nonnuclear methods［J］.Mol Imaging Bio，2005，7(1)：5-13.

［17］BULTE J W，KRAITCHMAN D L，MACKAY A M，et al.Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells is inhibited after magnetic labeling with ferumoxides［J］.Blood，2004，104(10)：3410- 3412.

［18］DICK A J，GUTTMAN M A，RAMAN V K，et al.Magnetic resonance fluoroscopy alllows targeted delivery of mesenchymal stem cells to infarct borders in swine［J］.Circulation，2003，108(23)：2899- 904.

［19］KRAITCHMAN D L，HELDMAN A W，ATLAR E，et al.In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction［J］.Circulation，2003，107(18)：2290- 2293.

［20］HILL J M，DICK A J，RAMAN V K，et al.Serial cardiac magnetic resonance imaging of injected mesenchymal stem cells［J］.Circulation，2003，2108(8)：1009-1014.

［21］BULTE J W，KOSTURA L，MACKAY A，et al Feridex-labeled mesenchymal stem cells：cellular differentiation and MR assessment in a canine myocardial infarction［J］.Mode Acad Radiol，2005，12 (Suppl 1)：S2- S6.

［22］BAKLANOV D V，DEMUINCK E D，THOMPSON C A，et al.Novel double contrast MRI technique for intramyocardial detection of percutaneously transplanted autologous cells［J］.Magn Reson Med，2004，52(6)：1438-1442.

［23］CYRUS T，WINTER P M，CARUTHERS S D，et al Magnetic resonance nanoparticles for cardiovascular molecular imaging and therapy［J］.Expet Rev Cardiovasc Ther，2005，3(4):705- 715.