散发性阿尔茨海默病患者BDNF基因G196A和C270T单体型及双体型分析

             作者：钱云，张志珺，张晓斌，袁勇贵，宇辉，施咏梅，柏峰，谢春明

【摘要】  目的：探讨脑源性神经营养因子（BDNF）基因G196A和C270T单核苷酸多态性（SNPs）在散发性阿尔茨海默病（sAD）发病机制中的作用。方法：采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，对105例sAD患者和105例健康对照者BDNF基因、载脂蛋白E(ApoE)基因多态性进行分析。结果：(1)sAD患者C270T但非G196A基因型及等位基因频率与对照组相比差异有统计学意义(P=0.034，P=0.011)。(2)BDNF G196A和C270T单体型分析发现，4种单体型在sAD组和对照组间差异有统计学意义(P=0.048)。对照组H4单体型频率显著高于sAD组，差异有统计学意义(P=0.024)；按ApoEε4分层后，在非ApoEε4携带者中，该差异仍有统计学意义(P=0.023)。对照组基于H4的双体型频率显著高于sAD组，差异有统计学意义(P=0.029)；按ApoEε4分层后，在非ApoEε4携带者中，该差异仍有统计学意义(P=0.040)。结论：BDNF C270T 位点的SNP可能与sAD的易感性相关，H4单体型及其构成的双体型是sAD的遗传保护因素，对非ApoEε4携带者而言尤其如此。

【关键词】  阿尔茨海默病； 脑源性神经营养因子； 载脂蛋白E； 单体型； 双体型

    阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)病因目前仍未明确，遗传因素是其发病的重要危险因素［1］。研究表明，载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）ε4等位基因是散发性AD（sporadic AD，sAD）的危险因素［2］，但并非ε4等位基因携带者均为AD，提示可能存在其他遗传危险因素。

    尸检发现，AD患者海马脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF) mRNA下降［3］。胎鼠细胞模型研究发现，BDNF基因G196A单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）可影响该基因的蛋白表达（缬氨酸替代蛋氨酸）［4］；有研究发现BDNF基因G196A、C270T与AD发病有关［5-6］，但目前仍存在争议。本研究对sAD患者BDNF基因G196A和C270T多态性及其与ApoE的相互作用进行分析。

    1  对象与方法

    1.1  对象

    sAD组患者105例，来自东南大学附属中大、南京医科大学附属脑科医院和江苏省扬州五台山医院，男48例，女57例，平均年龄（72.89±6.17）岁。痴呆的诊断标准采用美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册第4修订版（DSM-Ⅳ）标准。首先应用简易智能状态量表(MMSE)、日常生活活动能力量表(ADL)、画钟试验、临床痴呆量表（CDR）初筛有痴呆，然后根据文化程度对可疑痴呆患者进行详细的神经心检查，Hachinski缺血指数分＜4分，Hamilton抑郁量表排除抑郁症，全部进行头部影像学检查（CT或MRI），符合美国神经病学、语言障碍及卒中-AD和相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)很可能AD诊断标准，无阳性家族史。正常对照组105例，男47例，女58例，平均年龄（72.77±5.79）岁，无痴呆家族史，均为健康体检者。受试者均为汉族人，彼此无血缘关系，本人或其监护人知情同意，并获得东南大学附属中大医院伦理委员会的批准。

    1.2  方法

    1.2.1  模板DNA提取  取-80 ℃冰箱保存抗凝全血，采用KI法提取白细胞基因组DNA［7］，溶于TE缓冲液，-20 ℃保存。

    1.2.2  引物合成  引物参照［5- 6,8］由上海英俊生物技术有限公司合成。

    1.2.3  PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及限制性酶切PCR扩增产物  采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，参照文献［5- 6,8］对BDNF G196A、C270T和ApoE基因多态性进行分析，见表1。表1  BDNF G196A、C270T和ApoE的引物序列、酶切及电泳条件

    1.3  统计学处理 

    各组基因型和等位基因频率，检验其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。基因多态性位点基因型频率和等位基因频率比较用χ2检验。采用SHEsis软件［9］进行连锁不平衡及单体型分析。在单体型分析基础上，双体型分析依据两个双体型组执行，采用SPSS 13.0统计软件对每个双体型进行Fisher精确检验。所有统计检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  Hardy-Weinberg平衡法则的吻合度检验

    sAD组和对照组年龄（P=0.890）及性别（P=0.890）分布相似，差异无统计学意义。sAD组与对照组3个SNPs基因型观察值与期望值检测符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明其基因型频率分布已达到遗传平衡，具有群体代表性（ApoE vs sAD组χ2=1.052，P=0.789；vs 对照组χ2=3.017，P=0.389。BDNF G196A vs sAD组χ2=0.008，P=0.929；vs 对照组χ2=0.338，P=0.844。BDNF C270T vs sAD组χ2=0.002，P=0.961；vs 对照组χ2=2.688，P=0.101）。

    2.2  ApoE基因型和等位基因频率分布

    ApoEε4基因型在sAD组中占41.9%，对照组中占20.0%，两组差异有统计学意义（P=0.001）。两组ApoEε4与非ApoEε4的OR=2.885，95%CI为1.559～5.340（表2）。表2  sAD组和对照组ApoE基因型和等位基因频率分布注：（1)ApoEε4（+）表示1个或2个拷贝的ε4； ApoEε4（－）表示没有ε4拷贝； （2)括号内为所占百分比

    2.3  BDNF G196A、C270T基因型和等位基因频率分布

    BDNF G196A和C270T酶切图谱见图1、2。BDNF G196A基因型及等位基因频率在两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。BDNF C270T基因型及等位基因频率在两组间差异有统计学意义，sAD组T等位基因频率显著低于对照组（P=0.011），sAD组CT及TT基因型显著低于对照组（P=0.034），CC基因型在sAD组中占99.0%，对照组中占91.4%，两组差异有统计学意义（χ2=6.720，P=0.019，OR=9.750，95%CI为1.213～78.397）(表3)。 表3  sAD组与对照组BDNF基因G196A和C270T基因型和等位基因频率分布 注：括号内为所占百分比

    2.4  BDNF基因G196A和C270T连锁不平衡及单体型分析

    G196A和C270T之间存在弱连锁不平衡(弱连锁不平衡：D?＜0.5；强连锁不平衡：D?＞0.5；完全连锁不平衡：D?=1)（D?=0.164，r2=0.001）。等位基因G196与C270、270T以及196A与C270、270T配对分别呈单体型GC、GT、AC和AT。sAD组和对照组单体型频率均小于0.01时，数据将会被自动删除。对G196A和C270T进行单体型分析，4种单体型在sAD组和对照组间差异有统计学意义（χ2=7.890，P=0.048），其中H1和H2单体型是常见单体型，sAD组H4单体型频率显著低于对照组（P=0.024）(表4)。表4  BDNF基因G196A和C270T单体型分析注：H1、H2、H3、H4依次表示GC、AC、GT、AT； 两组间单体型比较， χ2=7.890,df=3,P=0.048； 括号内为所占百分比

    2.5  BDNF基因G196A和C270T双体型分析 

    在4种单体型分析基础上进行双体型分析，其中两个位点均是杂合子构成双体型频率在对照组中显著高于sAD组（sAD组 vs 对照组为0 vs 5.7%），差异有统计学意义（P＜0.05）。按ApoEε4等位基因分组发现，非ApoEε4等位基因携带者组，两个位点均是杂合子构成双体型频率在对照组中高于sAD组（sAD组 vs 对照组为0 vs 7.1%），差异有统计学意义（P＜0.05）(表5)。表5  BDNF基因G196A和C270T双体型分析 注：括号内为所占百分比

    3  讨    论

    BDNF基因位于11p13-p14，包括13个外显子，其编码的蛋白对神经元的存活非常重要［10］。人类BDNF主要由海马和大脑皮层的神经元产生，广泛分布于大脑皮层、海马和杏仁复合体，而这些区域在AD极早期即出现老年斑（senile plaques，SP）和神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）［11］。以上研究提示BDNF基因可能是AD的候选基因。

    网站上列出的关于BDNF基因与AD的22项研究中，有8项发现了阳性结果。关于G196A的11项高加索受试者研究的荟萃分析显示OR=1.08（95%CI为0.98～1.19），关于C270T的7项研究荟萃分析显示OR=1.09（95%CI为0.70～1.68）。我们的研究表明，BDNFG196A基因型及等位基因频率在sAD组与对照组之间差异无统计学意义，A等位基因频率在对照组中为49.5%，与Bian、He和Tsai等［12- 14］对人群的研究结果类似，均不增加AD的发病风险。而T等位基因可能是独立于ApoEε2之外的又一个sAD保护因素。sAD与C270等位基因正关联，CC基因型携带者患AD的风险比非CC基因型携带者明显增高，这与Desai等［15］的研究结果相反，可能是由于：(1)该等位基因与真正的致病位点存在连锁不平衡；(2)该等位基因可能是引起疾病的功能位点；(3)由于所选择的研究人群偏倚、人群分层而造成假阳性。

    对于复杂多基因疾病，基于连锁不平衡基础之上的关联分析比连锁分析对弱效基因的分析更具有统计效力，特别是在SNPs间LD系数较小时，如D?＜0.5。配对连锁不平衡结果表明，在中国汉族人群中，BDNF G196A- C270T之间存在弱连锁不平衡。考虑到BDNF基因可能是弱效基因，本研究单体型频率阈值设定为0.01，从而减少出现假阴性结果的可能。单体型分析表明，sAD与H4单体型显著负关联。同样，Tsai等［14］对人群的研究发现，H1单体型是AD的保护因素。虽然H4单体型在对照组中频率较低，但我们认为这个结果仍是有意义的，提示sAD发病是多个基因位点协同及交互作用所致。两组间双体型分析表明，基于两个多态性位点的杂合子组合的双体型亦是sAD的基因保护因素，尤其对非ApoEε4等位基因携带者来说。相对于ApoE基因而言，其他位点的致病作用均较微弱。此研究结果从分子生物学角度，进一步从基因水平提供了BDNF可能参与AD发病机制的实验依据。

    ApoEε4等位基因是公认的sAD的高危因素。我们的结果显示，sAD患者与ApoEε4等位基因显著正关联，再次验证了ApoE与sAD的相关性［16］。

    总之，我们首次发现BDNF G196A- C270T的单体型和双体型与sAD相关，且对非ApoEε4等位基因携带者亦然。重复本研究进一步阐明BDNF基因多态性及其各位点间单体型、双体型与AD关系以及与ApoE基因之间的交互作用很有必要，可能有助于AD的早期诊断，并在Aβ疫苗AD之外提供了神经营养因子干预措施的可能［17］。

    致谢  卫材（中国）药业有限公司给本研究提供了支持和帮助！

【】
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