重组人生长激素在体外对人胃癌细胞作用的研究
【摘要】 目的:研究重组人生长激素(rhGH)在体外对胃癌细胞生长的影响。方法:设对照组、rhGH组、5?氟尿嘧啶（5?FU）组和rhGH加5?FU 组共4组，依rhGH浓度不同，rhGH和rhGH加5?FU组又各分4个亚组。利用体外细胞培养、MTT比色、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法,测定不同浓度的rhGH对人胃癌细胞株MGC803肿瘤抑制率、细胞周期、细胞增殖指数（PI）及核增殖抗原Ki?67表达的影响。结果:rhGH在体外无明显促进MGC803细胞分裂增殖作用；对照组与各rhGH组比较，肿瘤抑制率、PI、Ki?67表达强度差异均无显著性(P>0.05)；rhGH各亚组间比较差异亦无显著性；5?FU组与rhGH组及对照组比较，各rhGH加5?FU组与rhGH组及对照组比较细胞抑制率增加,阻滞于G0～G1期的细胞数增加，S期细胞明显减少，PI明显降低(P<0.05)，Ki?67表达强度明显下降。结论:重组人生长激素在体外不会促进胃癌细胞的增殖。
【关键词】 胃癌；细胞周期；核增殖抗原；生长激素，人
生长激素（growth hormone,GH）具有直接的代谢调理作用，能促进蛋白质合成，增加脂肪氧化分解和糖异生，提高糖利用及营养物质转换率，同时提高1,25?(OH)2Vit D3水平，增加肠道对钙和磷的吸收。近年来，重组人生长激素（recombinant human growth hormone,rhGH）已经在改善高分解代谢状态患者的营养状况、纠正负氮平衡、促进伤口愈合及提高手术耐受性等方面得到广泛应用。GH纠正负氮平衡及调节免疫的作用，可用于晚期肿瘤患者以逆转其恶液质状态，但GH可能的促肿瘤细胞增殖作用限制了其在肿瘤患者中的应用。本实验旨在通过体外细胞培养观察rhGH对人低分化胃黏液腺癌细胞MGC803生长的影响，为rhGH能否用于临床胃癌患者提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器rhGH（瑞士雪兰诺大药厂馈赠的思真，Saizen），5?氟尿嘧啶（5?FU，南通精华制药厂），RPMI 1640(美国GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，四甲基偶氮唑蓝（MTT，Amresco公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，酶联免疫检测仪（BIO?RAD 550），流式细胞仪(FACS calibur型，美国BD公司)，一抗Ki?67、即用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术公司），人低分化胃黏液腺癌细胞株MGC803（解放军八一全军肿瘤中心）。
1.2 实验分组本实验设对照组（等体积RPMI 1640）、5?FU组（5?FU 10 mg·L-1）、rhGH组和rhGH加5?FU组共4组，后两组根据rhGH浓度不同又分为1～4 4个亚组，rhGH浓度依次为50、100、200及400 ng·ml-1。
1.3 细胞培养MGC803细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液(含青霉素100 U·ml-1,链霉素100 U·ml-1)中，于37℃ 、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用4 g·L-1台盼蓝染色后细胞存活率，并行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×105 ml-1备用。
1.4 MTT比色法检测癌细胞活性将单细胞悬液接种于96孔板，200μl·孔-1，每组设4个复孔。24h细胞完全贴壁后吸出各孔培养液，加入受试药物，置于培养箱中培养48h以检测各组细胞抑制率，另用同样方法培养0、24、48、72h以绘制细胞生长曲线。实验终止前4h加入MTT液20μl·孔-1（终浓度为5mg·ml-1），实验结束后倾去药液及培养液，每孔加入150μl DMSO，平板震荡仪震荡10min，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔光密度（OD）值，然后按下式计算细胞抑制率和生长率：抑制率=(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%；生存率=实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。
1.5 流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞增殖指数（PI） 各组细胞培养24h后消化、离心，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，获取1×106 ml-1以上的细胞，将收集标本荧光素(碘化丙锭)染色20min，用激发波长为488nm、接受波长为575nm的流式细胞仪进行细胞周期分析。根据细胞周期分析结果，按下式计算PI：PI=（S期细胞＋G2～M期细胞）/(G0～G1期细胞＋S期细胞＋G2～M期细胞)×100％。
1.6 免疫细胞化学检测各组细胞核增殖抗原Ki?67的表达 在24孔板中进行细胞爬片，加入各组受试药物，培养48h后取出玻片。冷丙酮固定10min后，采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物连接(SP)免疫细胞化学方法进行染色，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。Ki?67以1∶50稀释。根据阳性细胞着色面积和着色强度积分，应用Image?pro plus图像分析软件进行分析，每组选取10个高倍镜视野，用平均光强度表示Ki?67相对表达量。
1.7 统计学处理 所有资料均用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，数据用x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 细胞抑制率及细胞生长曲线
2.1.1 细胞抑制率 培养48h所得的实验各组OD值见表1。由表1可见，各rhGH组与对照组、各rhGH加5?FU组与5?FU组、各rhGH组内及各rhGH加5?FU组内比较，细胞抑制率和生存率差异无统计学意义(P>0.05)；各rhGH加5?FU 组、5?FU组分别与对照组比较细胞生长抑制率明显增加，生存率明显下降(P<0?05)；各rhGH加5?FU组与对应各rhGH组配对比较细胞抑制率也明显增加，生存率明显下降(P<0.05)。
2.1.2 细胞生长曲线 对照组与 各rhGH 组比较生长曲线无明显变化，各rhGH组间、各rhGH加5?FU组间生长曲线比较亦无明显变化，而对照组与5?FU组及各rhGH加5?FU组比较生长曲线明显抬高(图1)。
2.2 细胞周期分析和PI从表2可以看出，各rhGH加5?FU组与5?FU组细胞周期发生明显变化。各rhGH加5?FU组、5?FU组分别与对照组相比较，G0～G1期细胞增殖百分数明显增加，而S期细胞增殖百分数及PI显著下降(P<0?05)。各rhGH加5?FU组与其对应的各rhGH组配对比较，G0～G1期细胞增殖百分数明显增加，S期明显降低，PI显著降低(P<0.05)。对照组与各rhGH组、5?FU组与各rhGH加5?FU组、各rhGH组内以及各rhGH加5?FU组内比较细胞增殖百分数及PI差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 各组MGC803细胞抑制率的比较（略）
1)与对照组及各rhGH组比较，P<0.05
图1 各组细胞生长曲线比较（略）
2.3 Ki?67表达强度Ki?67表达以细胞核呈棕黄色或细胞核、细胞浆同时呈棕黄色为阳性，单纯的细胞浆着色而细胞核无着色或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。对照组、5?FU组、rhGH 2组、rhGH 3组、rhGH 2加5?FU组、rhGH 3加5?FU组平均光强度值依次为2.42±0.21、1?47±0?06、2?58±0?13、2?65±0?17、1?33±0?12及1?31±0?05。结果显示，Ki?67表达对照组与各rhGH组比较差异无显著性，各rhGH组间、各rhGH加5?FU组间比较差异亦无显著性，而对照组与 5?FU组及各rhGH 加5?FU组比较差异有统计学意义（P<0.05）。
表2 各组MGC803细胞增殖周期百分数及增殖指数比较（略）
1)与对照组及各rhGH组比较，P<0.05
3 讨论
GH具有直接的代谢调理作用：能促进蛋白质合成，减少蛋白质分解，维持氮平衡；能增加脂肪氧化分解和糖异生，提高糖利用及营养物质的转换率；能提高1,25(OH)2?Vit D3水平,增加肠道对钙、磷的吸收。许多研究表明，rhGH可刺激机体产生IgG、IgA及IgM，改善体液免疫功能，对T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及巨噬细胞的功能均有调节作用。目前rhGH主要应用于侏儒症、慢性肝病、Turner综合征、慢性肾衰、烧伤、不育症等的和大手术后恢复。rhGH可能的促肿瘤细胞增殖分裂，使得rhGH能否应用于肿瘤患者至今仍存在争议。有研究发现，GH缺乏的裸鼠可以抵抗化学物质诱发的乳腺癌，输注GH可诱导裸鼠乳腺上皮细胞增生和腺泡发育，可见GH在乳腺癌形成中的作用[1]。Ergun?Longmire等[2] 对GH缺乏的肿瘤患儿给予GH治疗，经随访发现，治疗组患者患二次肿瘤的风险高于未治疗组。另一方面，Fiebig等[3]发现体外实验中GH对7种不同的人肿瘤（结肠、胃、肺、乳腺、卵巢、前列腺癌和黑色素瘤）细胞没有显著的促增殖分裂作用。王琳等[4]探讨rhGH联合化疗对荷瘤小鼠的影响，结果显示：rhGH应用于荷瘤动物，未促进肿瘤进展，且对化疗无不良影响；联合化疗可明显延长小鼠的生存期，抑制肿瘤生长。已有的临床病例分析认为，GH 的应用不会增加肿瘤复发或患二次肿瘤的危险性，支持肿瘤患者使用GH的安全性[5]。但该类研究大多肿瘤类型单一，随访时间不够长，有待更广泛、长期的临床研究。rhGH促进肿瘤细胞的增殖分裂，从受体学说来看，其可能的作用机制是：GH通过与GH受体（growth hormone receptor,GHR）结合后产生各种生物学效应，通过一系列信号通路刺激胰岛素样生长因子?1（insulin like growth factor?1,IGF?1）的合成，从而形成GH?IGF轴。GH绝大部分通过GH?IGF轴发挥作用，但其本身也可与组织的GHR结合直接产生IGF非依赖的促细胞生长作用。众多研究都表明，在正常组织和肿瘤组织中，GHR的表达存在着不同程度的异常，这些异常和肿瘤的发生、及转移都有着密切的关系。刘建平等[6]应用放射性受体分析法测定显示，原发性肝细胞肝癌组织中GHR呈低水平表达。在早先的研究中已经证实胃酶原细胞和胃表面上皮细胞都有GHR表达，但胃癌组织中GHR表达的报道较少。研究较多的是IGF家族。有研究显示，胰岛素样生长因子?1受体（IGF?1R）在62%的人原发性胃癌病灶中有过度表达，并且随淋巴结转移数目的增加呈增高趋势[7]。另外，GH与催乳素受体（PRLR）关系密切，对灵长类动物来说，GH也可以作用于PRLR并发挥作用[8]，因此在研究GH的作用时很难区分是GHR介导的还是PRLR介导的。本实验通过体外药物浓度筛选得出5?FU对胃癌细胞株MGC803的IC50约为10mg·L-1。rhGH体外实验的浓度，大多数报道为50或100ng·ml-1，根据临床应用状况我们设置了200ng·ml-1次高浓度及400ng·ml-1高浓度组。Ki?67是全面反映细胞群体活性的良好标记物，它比PCNA能更直接地反映细胞的增殖情况，可以识别除G0期以外其他增殖周期的细胞，用于判断细胞的增殖活性。本实验通过使用免疫细胞化学的方法，比较不同组间Ki?67表达的差别，以间接反映rhGH是否对胃癌细胞具有促增殖作用。本研究结果显示，各rhGH组与对照组、各rhGH加5?FU组与5?FU组比较，细胞抑制率和Ki?67表达水平差异均无显著性(P>0.05)，细胞周期中各期细胞数量和PI差异亦无显著性(P>0.05)，表明rhGH对体外培养的胃癌细胞无促进增殖的作用。本课题组前期通过免疫组化的方法检测GHR及IGF?1R表达情况，结果显示，荷瘤裸小鼠肿瘤GHR及IGF?1R表达均呈阴性，由此我们推测，胃癌细胞可能由于不表达或微量表达GHR及IGF?1R，使得生长激素不能对其发挥促增殖作用。同时，还有学者认为rhGH增加机体免疫力，直接或间接产生细胞毒作用，从而不会促进肿瘤生长。本研究为肿瘤患者术后应用rhGH进行代谢调理、改善不能手术的中晚期肿瘤患者的恶病质以及降低化疗对机体的损伤等提供了一定的。
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