用原子力显微镜表征DNA纯化效果的实验研究

     作者：熊洁，陈宝安，巴龙，高峰，高冲，丁家华，孙耘玉，程坚，王骏，赵刚，杜鹃，陆祖宏

［摘要］

　　目的：运用原子力显微镜(AFM)表征3种DNA纯化试剂盒对DNA的纯化效果。方法：PCR扩增K562/A02细胞mdr1基因DNA,分别以3种不同的DNA纯化试剂盒对ＰＣＲ产物进行纯化后，按终浓度为10 ng・μl-1固定在用1 ng・μl-1 L型多聚赖氨酸预先处理过的新剥离的云母片上，用AFM获取DNA扫描图像，分析评价3种DNA试剂盒对DNA的纯化效果。结果:用AFM成功表征3种纯化试剂盒纯化后DNA片段，获得了清晰的DNA图像。对3种DNA纯化试剂盒的纯化效果作出评价，建议其中的两种DNA纯化试剂盒的DNA纯化产物可用于AFM的DNA 分析。结论：用AFM表征DNA时对DNA的纯度要求较高。通过对3种DNA纯化试剂盒纯化效果的比较，为AFM观测DNA样本的纯化方法提供了较好的方案。

　　［关键词］原子力显微镜;表征;脱氧核糖核酸;纯化

　　Abstract：Objective  To identificate purification effect of three kinds of DNA purification kits by atomic force microscopy(AFM).Methods  Cultivateion and PCR technique was used to amplify K562/A02 cells with DNA of mdr1gene. The amplified products were purified by three kinds of DNA purification kits， a final concentration of 10 ng・μl -1 DNA samples were placed on a freshly cleaved mica treated by 1ng・μl -1 Lpolylysine.AFM was used for the imaging of the three pieces of DNA samples.Results  Through AFM image analyzing, the purification effect of three kinds of DNA purification kits was evaluated, two kits can be used to purify DNA samples for AFM imaging. Conclusion   The higher the purify of DNA sample used, the better the AFM image got. Two better purification schemes have been achieved for DNA imaging using AFM through comparing three kinds of DNA purification kits.

　　Key words：atomic force microscope ; identification；deoxyribonucleic acid; purification 

　　原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）是具有原子级分辨率的新一代显微镜，因其能够对DNA、蛋白质、磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有机化合物的形态及功能进行观察研究而引起了人们的广泛关注［1］。近十几年，运用AFM在固相载体表面研究DNA分子技术取得的巨大进步, 大大地增进了人们在分子层面上对DNA分子的了解［25］。AFM在样本制备上相对较容易，但用于DNA研究时，要想得到质量较高的DNA图像对DNA样品的纯度要求较高。我们选择了3种不同的DNA纯化试剂盒对K562/A02细胞株mdr1基因769bp DNA的PCR产物进行纯化后在相同条件下用AFM观测，通过比较，建议其中的两种可用于AFM的DNA样品的纯化。

　　1  材料和方法

　　1.1  细胞培养

　　K562/A02细胞株由医学院血液学研究所杨纯正、齐静老师惠赠。细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司产品)培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，2~3d传代1次，实验前无药培养两周。

　　1.2  DNA提取

　　取对数生长期、终浓度2×105ml-1的K562/A02细胞3ml，以酚/氯仿法抽DNA后，加100μl TE缓冲液于-20℃保存。用紫外分光光度计定量，要求A260/A280≥1.8。

　　1.3  PCR扩增

　　从基因库中查得所需mdr1的基因序列号，引物根据基因库提供的基因全序列用机软件Primer3设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列：上游5′ATACTTTACTCCTTCCTTCAA3′，下游5′TCTGAATAAAGTAGATTTCTTCATG3′,扩增K562/A02 细胞mdr1基因-758～＋11的DNA,片段长度为769bp。PCR反应体系：纯化的DNA模板2.5μ1，50pmol・L-1上下游引物各1μ1，25mmol・L-1 MgCl2 1.5μ1， dNTP4μ1，5×PrimeStaRTM缓冲液(含Mg2＋)10μ1，10mmol・L-1 PrimeStaR HS DNA聚合酶0.5U,余用灭菌去离子水补至50μ1。热循环参数为： 98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min;扩增30个循环。

　　1.4  10g・L-1琼脂糖凝胶电泳

　　取10μl PCR产物，加2μl溴酚蓝上样缓冲液，加入3个点样孔行1.0%琼脂糖凝胶电泳，在TAE电泳缓冲液中，电压5V・cm-1,45min后取出凝胶置于紫外透射仪上显影拍照。

　　1.5  DNA纯化

　　在紫外特摄仪下切取3条含有清晰目的ＤＮＡ条带的凝胶块，分别用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP2092，TIANWEI公司产品）、DNA小量胶回收试剂盒（W5211,2408A,Waston公司产品）及琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（DV805A,TaKaRa公司产品）按相关说明书进行纯化，纯化样品于-20℃保存。

　　1.6  样本的制备

　　按Tanigawa等［6］的方法用1ng・μl-1 L型多聚赖氨酸(Sigma公司产品)预先处理新剥离的云母片(1.0cm×1.0cm)。多聚赖氨酸处理过的云母片用双面胶带粘附于甩膜机上，分别滴加以3种DNA纯化试剂盒纯化后，终浓度为10ng・μl-1的K562/A02 细胞mdr1 DNA样品20μl于云母片中央，并在室温下作用2min, 用7000r・min-1离心, 用吸量管吸1000μl去离子水滴加在旋转的云母片中央，冲洗3遍，时间持续1min，制备成3份DNA观测样品。

　　1.7  AFM观察和分析

　　样品使用Nanoscope AFM (Veeco/Digital Instruments, Santa Barbara, CA)观测, 在tapping模式下操作，像素密度为512×512，操作条件是室温、空气中，相对湿度不超过37%。用125μm 硅针尖tapping模式下共振频率为300~400kHz、针尖扫描频率为 1~2Hz进行扫描。获取扫描图像后，用Veeco/Digital Instruments公司的程序软件将图像进行去噪声处理，获得清晰的DNA图像。通过图像分析，评价3种试剂盒对DNA的纯化效果。

　　2  结果

　　2.1  获取DNA样品

　　用PCR的方法扩增K562/A02细胞mdr1基因769bp的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物（图1），切取3条清晰条带后分别用3种不同的DNA纯化试剂盒严格按相关说明书进行纯化，纯化样品于-20℃保存。
1~3.K562/A02；4.DNA Marker

　　图1  琼脂糖凝胶电泳检测K562/A02 mdr1基因DNA的PCR产物（略）
　　Fig 1  Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of K562/A02 cells mdr1 gene

　　2.2  通过AFM图像观测DNA评价3种不同DNA纯化试剂盒的纯化效果

　　通过AFM获取了3份不同纯化试剂盒纯化后DNA的清晰、分散图像（图2、3、4），所得的图像显示以上述方法制备的DNA样本均能达到较好的线性化，说明我们的样本制备是成功的。在DNA样本来源、样本制备方法、操作模式及观测条件均相同的情况下，并排除了云母表面吸附力大小、 DNA浓度及灰尘等对样品分散的影响，我们通过图像观察发现，经TIANWEI公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化后的DNA样本（如图2）中含有较多的大小不均的颗粒杂质，制片背景不清晰，有少量颗粒粘附于DNA 上，可能会影响对DNA的轮廓观察及模数分析，因此我们推断该种试剂盒的DNA 纯化产物不能达到AFM对DNA观测要求。经Waston公司的DNA小量胶回收试剂盒纯化后的DNA样本（如图3）及TaKaRa公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒纯化后的DNA样本（如图4）制片背景清晰，所含的杂质成份较少，DNA轮廓清晰，能够较为准确地反映DNA的真实构象，我们认为这两种试剂盒的DNA 纯化产物符合AFM对DNA观测标准，可用于AFM观测DNA样本的纯化。

　　图2  用TIANWEI公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化后DNA的AFM图像（略）
　　Fig 2  AFM iamge of target DNA purified by DNA isolation kit(TIANWEI Co.,Ltd.)

　　图3  用Waston公司的DNA小量胶回收试剂盒纯化后DNA的AFM图像（略）
　　Fig 3  AFM iamge of target DNA purified by DNA isolation & purification kit(Waston Co.,Ltd.)

　　图4  用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒纯化后DNA的AFM图像（略）
　　Fig 4  AFM iamge of target DNA purified by agarosegel DNA purification kit(TaKaRa Co.,Ltd.)

　　3  讨论

　　AFM具有非常高的横向和纵向分辨率,其横向分辨率可达0.1～0.2nm，纵向分辨率高达0.01nm， 可以得到纳米级的、清晰的生物样品三维结构图像［7］，加之其具有很宽的工作范围，近几年在生物医学研究中得到了广泛应用。

　　AFM可以清晰观察到体外生理状态下各种DNA分子的三维结构，并可以测算出分子的宽度和高度，尤其对高度可以精确地测算［8］。用AFM对DNA进行观测时，采用高质量的DNA样品可以得到较为真实可靠的测量结果，从而保证DNA形态研究的准确性，因此对DNA样本的纯化和制备过程要求较高。我们的试验结果显示，用AFM表征的3份DNA样品均呈现清晰、分散的DNA结构图像，表现出较好线性化，无盘结缠绕，说明我们的样本制备是成功的。在相同试验条件及排除混杂因素的情况下，通过图像比较分析我们发现，Waston公司的DNA小量胶回收试剂盒及TaKaRa公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒纯化后的DNA样本的图像效果较好，符合AFM的DNA观测标准，可用于DNA的形态研究。

　　本试验通过AFM图像观测，比较了3种不同的DNA纯化试剂盒对同一DNA样本的纯化效果，为使用AFM观测DNA时能得到较高质量的DNA图像，就样本的纯化提出了一些建议。

　　［］

　　［1］SHAO Z.Probing nanometer structures with atomic force microscopy［J］. News Physiol Sci, 1999, 14:142149.

　　［2］MAREK J, DEMJENOVA E, TOMORI Z. Interactive measurement and characterization of DNA molecules by analysis of AFM images［J］. Cytometry A, 2005, 63(2):8793.

　　［3］NAKAO H, HAYASHI H, YOSHINO T, et al. Useful technique for DNAstretching and fixation［J］. Nucleic Acids Res Suppl, 2002,(2):28990.

　　［4］KAJI N, UEDA M, BABA Y. Molecular stretching of long DNA in agarose gel using alternating current electric fields［J］. Biophys J, 2002,82(1 Pt 1):335344.

　　［5］KIM J M, OHTANI T, PARK J Y,et al. DC electricfieldinduced DNA stretching for AFM and SNOM studies［J］. Ultramicroscopy, 2002,91（14）:139149.

　　［6］TANIGAWA M, GOTOH M, MACHIDA M，et al. Detection and mapping of mismatched base pairs in DNA molecules by atomic force microscopy［J］. Nucleic Acids Res, 2000,28(9):E38.

　　［7］张德添,何昆,张飒,等.原子力显微镜近况及其应用［J］.仪器,2002，(3):69.

　　［8］HOYT P R, DOKTYCZ M J, WARMACK R J, et al. Spincolumn isolation of DNAprotein interactions from complex protein mixtures for AFM imaging［J］. Ultramicroscop,2001,86(12):139143.