造血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的研究进展
【关键词】 下肢缺血
严重的下肢缺血是临床上常见的致残性疾病，以高发生率、高致残率和高死亡率严重影响着人们的生活质量甚至危及生命。静息痛、皮肤溃疡或坏疽是典型的临床表现。尽管目前的研究在下肢血管再生技术上有一定的进展，但仍有一些病例除了截肢别无选择。正因为如此，人们对增加血管生成严重的下肢缺血有浓厚的兴趣。血管生成已成为一种治疗缺血性疾病的新方法[1]。近年来，随着对各种成体干细胞生物学特性认识的不断深入以及分离、纯化这些干细胞手段的不断改进，使采用细胞治疗等治疗性血管生成方法在梗死部位重新建立有效的侧支循环逐渐成为可能[2]。
1 基础理论
干细胞是具有自我更新高度分化能力的细胞群，可以通过细胞的分裂产生表型与基因型完全相同的子细胞以维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化产生至少一种类型的高度分化的子细胞。干细胞是自我复制还是分化成为功能细胞，主要由于细胞本身的状态和微环境因素所决定。干细胞本身的状态包括调节细胞周期的各种周期素和周期素依赖激酶、基因转录因子、影响细胞不对称分裂的细胞质因子。微环境因素包括干细胞与周围细胞，干细胞与外基质以及干细胞与各种可溶性因子的相互作用。根据干细胞的发生来源，干细胞可以分为胚胎干细胞和组织干细胞（即成体干细胞）。组织干细胞主要包括：造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCS）、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、肌肉卫星干细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞等。HSCS具有很强的可塑性，除了可以被诱导分化为各系的血细胞外，还可被诱导分化为非造血组织的细胞，例如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)以及多种组织的上皮细胞。造血干细胞一直以来是家们研究的重要领域之一，很多有关干细胞特性和应用的探讨都是从造血干细胞深入和拓展的。利用HSCS表面的标志蛋白质CD34+，可以将其分离并富集。由于人体的HSCS主要存在于骨髓中，因此临床上多采用骨髓来源的HSCS进行移植，后来研究者发现，外周血的CD34+细胞表面表达高亲和力的造血生长因子受体，应用这些细胞因子和（或）化疗动员后，外周血中的CD34+细胞含量显著增加，与骨髓中的含量相当。因此，动员的外周血成为HSCS移植的另一来源。HSCS移植的另一来源是脐带血。脐带血含有丰富的HSCS，并且其免疫细胞的抗原性较弱，因此被认为继骨髓和外周血以外的极具潜力的HSCS移植的第三种来源。
2 基础研究
干细胞可分化为VEC,进一步分化形成新生毛细血管,干细胞移植正是利用这一原理,将干细胞移植到缺血的肢体肌肉中,使其分化形成新生毛细血管,改善和恢复下肢血流以达到治疗下肢缺血的目的。VEC的增殖、分化、迁移诱导毛细血管生成[3]。骨髓细胞含有多种能分化成造血细胞和内皮祖细胞的幼稚细胞。实验Kawamura A等证实[4]：在体外，来源于骨髓细胞CD34+细胞的某一亚群能分化形成VEC。在体内，能被诱导形成小血管的内表面。而且已证实：骨髓细胞能分泌诸如碱性成纤维细胞因子和促使血管假体管腔内表面内皮化的细胞因子。梁雪梅等经动物实验表明[5]人外周血和脐血单个核细胞可提高免疫缺陷鼠肢体缺血部位的毛细血管密度，自体骨髓单个核细胞植入缺血的肢体可促进局部的血管形成，提示有望用干细胞移植治疗下肢缺血性疾病。Hamano等认为[6]，在下肢缺血模型，局部注射1×109／ml浓度的骨髓悬液总体积10μl是合适的。赵玉国等[7]应用总体积50μl、浓度为1×109／ml的骨髓悬液注射于缺血下肢内收肌和腓肠肌的七个位点，同样取得明显的治疗作用，证实了自体骨髓干细胞移植后的新生血管量与悬液浓度有关而非剂量依赖性。Hamano等认为[6]在下肢缺血模型中成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, bFGF)和白细胞介素-1（ ,IL-1β）在血管生成时起重要作用，而与血管内皮生长因子 (vascular endothelial growthfactor , VEGF)无关。其机制可能是缺血早期缺血本身增加 bFGF的水平，移植的骨髓细胞释放IL-1β的增加，从而诱导血管的生成。但Kobayashi等认为[8]血管生成的增加与VEGF和bFGF都无关，因为在肢体缺血模型VEGF和bFGF的蛋白表达没有显著增加。在体内外，已证实有促进血管生成潜力的炎症因子如IL-1β和细胞因子诱导中性粒细胞化学趋化因子的蛋白表达在骨髓细胞移植组却明显增高。kalka[9]等研究发现肢体缺血的治疗应重视内皮祖细胞在缺血组织的归巢和在原位分化，因此采用的缺血肢体局部肌肉注射的方法可能是解决此问题的有效方法。
3 临床研究
Tateishi-Yuyama等在国际上首次报道了应用骨髓HSCS移植治疗周围血管病患者的临床报告[10]，接受自体骨髓单个核细胞移植治疗的43例下肢动脉缺血性疾病患者均获得了满意的疗效，且未发现任何明显的移植相关不良反应。国内谷涌泉等报道应用自体骨髓HSCS移植治疗严重下肢缺血获得成功[11] [12],但由于骨髓采集需全身麻醉，对患者的全身情况要求高，而且采髓量较大，部分患者心理上难以接受。Kawamura A,等报道[13]应用外周血HSCS移植治疗下肢缺血，21例患者22条严重缺血的肢体得以挽救,国内由黄平平、李尚珠等报道[14]应用外周血HSCS及脐血HSCS移植治疗下肢缺血获得满意的临床效果。
3.1 方法 首先在局麻下抽取自体骨髓分离出单个核细胞（可定向分化的干细胞），或应用粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor ，G-CSF)促进骨髓增生,提高外周血中HSCS数目。6d后抽取外周血，应用干细胞分离机采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血中的干细胞（CD34+细胞）。在腰椎管内麻醉后，无菌条件下，将分离的干细胞纵行、多点注射于动脉闭塞水平以下的患肢肌肉内，两点间距2cm，每点注射1.5～2.0ml[15]。
3.2 结果 通过术后定期记录患者的症状变化，溃疡愈合的情况，测量患肢皮温，足背静脉充盈时间和ABI，以及术后血管彩超及造影情况，并与移植前比较。杨学芳等报道[16]应用外周血HSCS移植治疗下肢缺血患者63例，随访半年疼痛消失占87%，冷感消失占90%,踝肱指数升高占34.3%,治疗期间无相关并发症发生。临床研究证实造血干细胞移植治疗后，患肢的皮温、颜色、侧枝循环的建立均较对比组明显改善，新生细小血管明显增多，提示干细胞移植确可有效增加患肢侧枝循环的建立，改善患肢的供血，降低该病的致残率，提高患者的生存质量，是一种安全有效的治疗下肢动脉缺血的新方法[17]。
4 问题及展望
造血干细胞移植下肢缺血性疾病临床应用时间短，病例数不多，经验不足，有许多问题有待研究：第一干细胞具有多种分化方向，移植的干细胞是否会引起其它问题，以及如何诱导其向血管内皮细胞定向分化。第二 对于健康人，G-CSF仅仅引起一过性骨髓增生，停药后可很快自行恢复，但对于具有潜在的骨髓增生异常倾向的人，G-CSF有诱发血液病的可能性。因此应用G-CSF的安全性尚需进一步观察、研究[18]。第三干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的远期效果如何，还需要多病例的累积和长时间的随访。
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