骨髓CD117+Lin-细胞移植对小鼠酒精性肝纤维化的影响

来源:岁月联盟 作者: 时间:2010-07-12

                  作者:廖彩佶,廖彩仙,张守华,张春兴,赖勇强

【摘要】  目的 探讨骨髓源性肝干细胞(BMDLSC)移植对肝纤维化病变的影响。方法 16只酒精性肝纤维化雌性小鼠随机分为移植组和对照组,移植组小鼠(n=8)接受同基因型雄性小鼠的骨髓CD117+Lin-细胞移植,对照组小鼠(n=8)接受等体积的Buffer2液输注。术后30天活杀小鼠进行肝功能、肝组织HE染色和VG染色、肝组织Y染色体和白蛋白双重原位杂交等检查。结果 移植组的肝功能和肝结构恢复显著优于对照组,肝内纤维数量显著少于对照组,既带Y染色体又表达白蛋白的双阳性细胞仅在移植组的肝组织中出现。结论 BMDLSC移植可以显著改善小鼠酒精性肝纤维化病变的结构与功能。

【关键词】  CD117+Lin-细胞移植;酒精性肝纤维化;小鼠

    【Abstract】  Objective  To explore the action of transplantation of bone marrow-derived liver stem cells(BMDLSC)on hepatic fibrosis induced by alcohol in mice. Methods  16 female mice with alcoholic liver fibrosis were randomly divided into group A and B. The mice in group A(n=8) received syngeneic male bone marrow CD117+Lin- cell transplantation. The mice in group B(n=8) received isovolumetric Buffer 2 solutions infusion. The examinations of hepatic function, hepatic tissue stained by HE and VG, double in situ hybridization of albumin and Y-chromosome were performed at the 30th day postoperatively.Results  Double labelling positive cells were seen only in group A. The hepatic function and morphosis restoration in group A were significantly better than those in group B. The number of intrahepatic fibers in group A were markedly less than those in group B. Conclusion  BMDLSC transplantation could ameliorate remarkably the hepatic structure and function of the mice with alcoholic liver fibrosis.

    【Key words】  CD117+Lin- cell transplantation; alcoholic liver fibrosis; mouse

    最近唐浩等[1]学者发现,小鼠骨髓源性肝干细胞(BMDLSC)移植对放射性肝损伤具有良好的修复作用,并且可以有效预防放射性肝纤维化形成。但是,对于已经出现的肝纤维化病变,BMDLSC移植可否使其发生变化?目前尚不清楚,也未见报道。笔者为此对肝纤维化小鼠接受骨髓CD117+Lin-细胞移植后的变化进行了观察,发现骨髓CD117+Lin-细胞移植可以显著改善小鼠酒精性肝纤维化病变的结构与功能。

    1  材料与方法

    1.1  小鼠酒精性肝纤维化模型的建立  SPF级纯系BALB/C雌性小鼠,体重15~18g。参照苏俊等[2]介绍的方法,给予54度白酒灌胃,每天2次,持续16周。第1~3周每次8ml/kg白酒灌胃,第4~7周每次10ml/kg,第8~16周每次12ml/kg。同时将54度白酒用蒸馏水配制成含酒精10% (v/v)白酒作为实验小鼠的唯一饮料。

    1.2  小鼠分组  (1)移植组:为酒精性肝纤维化雌性小鼠接受同系雄性小鼠骨髓CD117+Lin-细胞移植组,8只小鼠。(2)对照组:为酒精性肝纤维化雌性小鼠接受等体积Buffer2液输注组,8只小鼠。

    1.3  小鼠骨髓CD117+Lin-细胞分选  BALB/C雄性小鼠8只,无菌条件下获取股骨和胫骨骨髓,收集骨髓细胞悬液。经裂解红细胞、8℃条件下离心、尼龙膜过滤等处理,获得骨髓细胞悬液。应用免疫磁珠分选法[3],第一步采用阴性分选,从骨髓细胞悬液中分选出Lin-细胞,即CD3ε、CD4、CD8a、CD45R、Gr21、Ter-119、CD11b阴性细胞。第二步采用阳性分选,从Lin-细胞中分选出CD117+Lin-细胞。最后用Buffer2液(pH7.2 PBS+0.5%BSA +2mmol/L EDTA)重悬细胞,并将细胞浓度调节至1×109/L。

    1.4  CD117+Lin-细胞移植  移植组小鼠均经尾静脉注入CD117+ Lin-细胞悬液250μl(2.5×105个细胞),对照组小鼠均经尾静脉注入250μl Buffer2液。

    1.5  观察指标与检测方法  移植后30天,活杀小鼠进行如下检测。

    1.5.1  肝功能测定  内容包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、 天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)。

    1.5.2  肝组织病检查  内容包括HE染色和VG染色检查。

    1.5.3  肝组织白蛋白mRNA和Y染色体Sry DNA双重原位杂交检查  探针由天津瀚洋生物有限公司提供。ALB mRNA探针序列为:5’-TTGGCAAGTT  CCGCCCTGTC  ATCTGCGC (TAMRA红色荧光标记),小鼠Y染色体性别决定基因(Sry)DNA探针序列为:5’-GCTGGGATGC AGGTGGAAAA GCCTTACAG(FAM绿色荧光标记)。杂交方法按照试剂盒所附方法进行,在同一张组织切片上先后进行ALB mRNA杂交和Sry DNA杂交。荧光显微镜观察结果。胞浆内含绿色颗粒表示该细胞含Y染色体,胞浆内含红色颗粒表示该细胞表达白蛋白,胞浆内含黄色颗粒表示该细胞既含Y染色体又表达白蛋白。

    1.6  统计学方法  数据以x±s表示,分析比较采用t检验。

    2  结果

    2.1  各组小鼠移植后30天的肝功能结果  见表1。表1  移植组与对照组小鼠在术后30天的肝功能变化 注:*P为移植组与对照组比较结果

    2.2  肝组织的病改变  对照组小鼠肝组织HE染色显示,大量肝细胞脂肪变性,胞浆透明。肝小叶点状坏死,汇管区纤维细胞增生,肝小叶内可见纤维间隔,假小叶形成。肝组织VG染色显示,肝内纤维重度增生,肝小叶内、汇管区及肝窦内均有较多粉红色胶原纤维沉积,见图1。移植组小鼠肝组织HE染色显示,肝细胞轻度浊肿变性,肝小叶内无坏死灶,偶见少量纤维索,肝窦区无明显炎性浸润,汇管区纤维增生明显,无明显假小叶形成。肝组织VG染色显示,肝内纤维中度增生,汇管区及肝窦内都有粉红色胶原纤维沉积,但数量均显著少于对照组,见图2。

    2.3  肝组织白蛋白和Y染色体双重原杂交结果  对照组结果见图3,没有含黄色颗粒的双阳性细胞。移植组结果见图4,可见含黄色颗粒的双阳性细胞呈散在分布。

    3  讨论BMDLSC是近年才发现的一群细胞,属于骨髓干细胞的一个亚群,但这个亚群的确切表型特征至今还没有阐明。CD34、CD90、CD117、CD133、Sca-1、CXCR4都有可能是BMDLSC的表面标志[4,5],但都不可能是该亚群的特征性标志,因为这些细胞都是异质细胞群,不是均质细胞。笔者曾利用移植试验法对骨髓干细胞中的BMDLSC进行筛选,证明CD117+Lin-细胞是一群富含BMDLSC的骨髓干细胞亚群[6]。对于肝纤维化病变,BMDLSC移植可否使其发生逆转?目前还未见报道。在本实验中,肝组织HE染色显示,移植组的肝组织结构修复显著优于对照组;肝组织VG染色显示,移植组的肝内纤维数量显著少于对照组。提示酒精性肝纤维化小鼠在接受BMDLSC移植后,肝纤维化病变的结构在发生改建,肝内纤维化在减少,肝组织结构在恢复。结合本实验中移植组的肝功能恢复显著优于对照组,表明BMDLSC移植对小鼠酒精性肝纤维化的结构与功能具有显著改善作用。在本实验中,移植组的小鼠肝组织中出现既带Y染色体又表达白蛋白的双阳性细胞,表明移植的BMDLSC已经在肝内定居并且产生了新的肝细胞。

【】
  1 唐浩,廖彩仙,周杰,等. 小鼠 C-kit+ Lin- 骨髓细胞移植生成肝细胞的实 验研究.南方医科大学学报,2006,26(5):567-98.

2 苏俊, 廖彩仙, 周杰,等. 构建适合骨髓衍生肝干细胞移植的小鼠酒精性肝纤维化模型.组织工程研究与临床康复,2007,11(4):649-652.

3 张春兴, 廖彩仙, 张守华,等. 免疫磁珠分选骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit+lin-.中国组织工程研究与临床康复,2007,11(7):1232-1234.

4 Crosby HA. Human hepatic stem-like cells isclated using c-kit or CD34 can differentiate into biliary epithplium. Gastroenterology,2001,120:534-544.

5 Kucia M, Wysoczynski M, Ratajczak J, et al.Identification of very small embryonic like (VSEL) stem cells in bone marrow. Cell Tissue Res,2008,331(1):125-34.

6 廖彩仙,唐浩,周杰,等.小鼠骨髓源性肝干细胞筛选及其分化潜能的研究. 中华肝胆外科杂志,2007,13(9):614-616.