实时荧光定量RT?PCR检测鼻咽癌骨转移相关基因表达的研究
作者：翟晓晓，刘腾飞，姚开泰
【摘要】 目的 研究CXCR4、CTGF、MMP?1、IL?11、MST1R、ETV?1 6种基因在鼻咽癌细胞5?8F与骨共培养前后的表达情况，分析这些基因在鼻咽癌骨转移中的作用。方法 采用基于SYBR GREENⅠ法的实时荧光定量RT?PCR检测5?8F细胞与骨共培养前后骨转移相关基因的表达情况。结果 5?8F细胞与骨共培养后CXCR4、CTGF、MST1R、ETV?1的表达水平较共培养前差异有显著性 (P<0.05)，均表达上调；MMP?1、IL?11则差异无显著性。结论 实时荧光定量RT?PCR能够敏感、特异地检测出鼻咽癌细胞在与骨组织共培养前后的mRNA的表达变化，方法准确可靠，操作方便；CXCR4、CTGF、MST1R、ETV?1有可能成为判断鼻咽癌骨转移的潜在标志物。
【关键词】 实时荧光定量RT?PCR；骨转移相关基因；鼻咽癌
Abstract:Objective To compare the expressions of CXCR4, CTGF, MMP?1, IL?11, MST1R, and ETV?1 mRNA in NPC cell line 5?8F and 5?8F co?cultured with bone tissue and analyze the relationship between related mRNA expression levels and the bone metastasis of NPC.Methods The mRNA expressions of six genes in NPC cell line 5?8F and 5?8F co?cultured with bone tissue by SYBER GREEN ⅠReal?time Fluorescent Quantitative RT?PCR. Results The expressions of CXCR4, CTGF, MST1R and ETV?1 were higher in 5?8F co?cultured with bone tissue than 5?8F with significant difference (P<0.05);But the expressions of MMP?1 and IL?11 exhibit no significant difference.Conclusion CXCR4, CTGF, MST1R, and ETV?1 may be used as a potential molecular targets for the diagnosis of bone metastasis in NPC.
Key words:real?time fluorescent quantitative RT?PCR;bone metastasis gene; nasopharyngeal carcinoma
骨转移是晚期恶性肿瘤的常见并发症，近年来逐渐成为肿瘤转移机制研究领域的热点之一，在骨转移的发生过程中，由于骨组织微环境与肿瘤细胞的相互作用，使得肿瘤细胞具有特定的基因型。研究发现［1］：趋化因子受体4（chemokine receptor 4，CXCR4）、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、基质金属蛋白酶?1 (matrix metalloprotease?1,MMP?1)、白细胞介素?11（interleukin?11）是乳腺癌骨转移的标签基因；巨噬细胞刺激蛋白受体（macrophage stimulating 1 receptor,MST1R)在乳腺癌骨转移中发挥作用［2］;而ETV?1 (ETS variant gene 1 )则在前列腺癌的骨转移中表达增高［3］。
鼻咽癌作为我国南方常见的上皮性恶性肿瘤，远处转移以骨最为常见，本研究选取较常规RT?PCR更好的实时荧光定量RT?PCR（real time fluorescence quantitative PCR，FQ?PCR）技术对目的基因在鼻咽癌细胞株与骨共培养前后的表达情况进行研究，以探讨上述6个基因在鼻咽癌骨转移中的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞
鼻咽癌细胞株5?8F为本实验室冻存，低分化人鼻咽癌细胞株，细胞均呈上皮样，贴壁生长，生长培基为含有10％(φ)新生牛血清的RPMI?1640。
1.2 实验动物
6～8周龄BALB/c裸鼠，SPF级，合格证号：SCXK（粤）2006-0015 2006B023 2006A048，体质量16～20 g，雌雄不限，购自南方医科大学实验动物中心。
1.3 主要试剂和仪器
BGJb培养基购自Invitrogen公司，RPMI?1640购自Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青，Trizol试剂购自Invitrogen公司，Stratagene公司的Mx3000P Real Time PCR扩增仪， PrimeScriptTM RT?PCR试剂盒以及SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购自Takara。
1.4 共培养实验
从裸鼠取前肢骨和后肢骨（包括大腿骨、胫骨、肱骨和桡骨），去除骨周围的肌肉，沿长轴切开骨干，使骨髓腔暴露，切成0.8 cm长的骨块置于含有抗生素的BGJb培养基中，37 ℃平衡24 h后，将3～5块骨组织加入到生长有5?8F细胞的T25培养瓶中，与5?8F细胞进行共培养，培养基为含抗生素和5％胎牛血清的BGJb和RPMI?1640（体积比1∶1）混合培养基，连续培养24 h。
1.5 引物设计
所有引物（见表1）均用引物设计软件PrimerPrimer 5. 0设计，由上海英俊公司合成。
表1 CXCR4、CTGF、MMP?1、IL?11、MST1R、ETV?1及β?actin的引物序列（略）
Tab.1 Primer Sequences of CXCR4、CTGF、MMP?1、IL?11、MST1R、ETV?1and β?actin
1.6 RNA抽提 共培养结束24 h后，弃去骨组织，D?hank’s冲洗5?8F细胞3次，加入1 mL Trizol 裂解液，冰上5 min，加入200 μL氯仿振荡混匀，4 ℃, 12 000 g,离心15 min,吸取上清液至另一灭菌Ep 管内, 加入等体积异丙醇,室温沉淀10 min后,4 ℃，12 000 g，离心10 min,弃尽上清,加入1 mL 75 %酒精（φ）洗涤沉淀, 4 ℃ 12 000g,5 min,弃尽上清,室温干燥1～3 min,加入20 μL 1‰焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate, DEPC)处理水溶解。
1.7 反转录反应 按试剂盒要求，吸取2 μL总RNA，反转录成cDNA。逆转录条件：42 ℃ 20 min，95 ℃ 5 min。
1.8 荧光定量RT?PCR的检测 反应体积为20 μL,反应体系: SYBR Premix Ex Taq (2×)10 μL,上游引物F (10 μmol/L)0.4 μL,下游引物R (10 μmol/L)0.4 μL, ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.4 μL, cDNA 1 μL,ddH2O 7.8 μL；以β?actin为内参。反应条件为:（1）预变性95 ℃ 60 s(2)95 ℃ 5 s,61/55/52/60/57/55 ℃ (CXCR4/CTGF/MMP?1/IL?11/MST1R/ ETV?1)15 s, 72 ℃ 5 s共45 个循环(3) 95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。
1.9 统计学处理
计量数据以±s表示，用SPSS 11.5软件对未处理样本（共培养前5?8F）与处理样本（共培养后5?8F）的ΔCt进行两独立样本的t检验（双侧）分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 FQ?PCR检测5?8F细胞与骨组织共培养前后6个目的基因以及内参的扩增曲线 见图1。
2.2 FQ?PCR检测5?8F细胞与骨组织共培养前后6个目的基因以及内参的熔解曲线 见图2。
从熔解曲线图中可以看到，β?actin熔解温度为89 ℃，不同的基因产物对应不同的熔解温度；在不同样本中，同一基因产物的熔解温度大致相同，证明所扩增的产物特异性较好。
2.3 6种基因在鼻咽癌细胞5?8F与骨组织共培养前后的表达差异
FQ?PCR中，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，反之，Ct值就越大。在相对定量分析中，将同一样本中目的基因的Ct值与内参基因的Ct值相减，所得出的ΔCt为目的基因相对于内参基因的表达强度，即ΔCt＝目的基因Ct?内参基因Ct。再使用2-ΔΔCt方法将目的基因的表达差异通过处理样本相对于未处理样本的倍数来表示，-ΔΔCt＝-（ΔCt处理样本-ΔCt未处理样本）。2-ΔΔCt>1,目的基因表达上调，反之下调。
