HPLC法测定磺啶冰黄片中胆红素的含量

【摘要】  目的 建立高效液相色谱法测定磺碇冰黄片中胆红素含量的方法。方法 采用HPLC法进行测定，色谱柱为Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:为氯仿-甲醇-2%二乙胺水溶液（80∶19∶1），检测波长：450 nm，流速：1 mL/min，柱温：45 ℃。结果 胆红素在一定色谱条件下能完全分离，在0.62～1.85 ?滋g/ml浓度范围内线形关系良好，线性回归方程Y=5 165 741X-61 229，γ=0.999 9，加样回收率为99.2%；RSD为1.1%（n=9）。结论 本方法测定磺碇冰黄片中胆红素的含量,准确可靠,方法简便。

【关键词】  磺碇冰黄片；胆红素；HPLC法；含量测定

    磺啶冰黄片为近来临床上常用的一类复方抗菌药，现行方法对其所含的磺胺甲口恶唑，甲氧苄啶作了含量测定的规定[1]，而对其中的人工牛黄的含量控制未作要求。人工牛黄中主要成分为胆红素，故我们用外标法对其含量进行测定，为药品提供良好的质量控制依据。

    1 实验材料

    1.1  仪器

    LC-10ATVP高效液相仪(日本岛津)， SPD-10AVP紫外检测器(日本岛津)，色谱工作站（浙江大学N3000）， AB135-S分析天平(瑞士梅特勒)，AEU-210电子分析天平(湘仪)， UV-2401紫外分光光度计（日本岛津)。

    1.2  试药

    磺碇冰黄片;山西晋华药业有限公司（批号20030402 20030503 20030801）；胆红素对照品（药品生物制品检定所，规格:20 mg,批号10077-0201）；甲醇,氯仿和二乙胺均为色谱纯；水（超纯水），科室自制。

    2 方法与结果

    2.1  色谱条件

    色谱柱：Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：氯仿-甲醇-2%二乙胺水溶液（80∶19∶1）[2]；检测波长：450 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：45 ℃。

    2.2  溶液的制备

    2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取胆红素对照品约10.30 mg置100 mL棕色量瓶中，加氯仿80 mL，超声处理10 min，迅速放冷至室温，并用氯仿稀释至刻度摇匀，精密量取5 mL置50 mL棕色量瓶中，用氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为对照液。

    2.2.2  供试品溶液的制备  取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（1片量）置50 mL棕色量瓶中,加氯仿约50 mL超声处理10 min，速放冷至室温，并用氯仿稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液20 mL置50 mL棕色量瓶中，用氯仿稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤过，作为供试品溶液。

    2.2.3  阴性对照液  取除人工牛黄以外的其他三味药品按处方制备成缺人工牛黄样品，再按“2.2.2”项下制备，即得。

    2.3  系统适用性试验

    分别取对照品溶液、样品溶液、阴性对照液注入色谱仪，记录色谱图，从图1中可以看出，阴性对照色谱图在对应的胆红素位置处无干扰峰，即表明其它组分对测定无干扰。胆红素与其它组分峰的分离度都大于1.5。理论板数以胆红素峰计，不低于1 500。

    2.4  标准曲线的制备

    精密量取对照贮备液0.60、0.90、1.20、1.50、1.80 mL于10 mL棕色量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀。分别进样10 μL，记录色谱图，由峰面积（Y）(n=3)对相应的浓度（X）直线回归，胆红素回归方程为：

    Y=5 165 741X-61 229，γ=0.999 9

    线性范围为0.62～1.85 μg/mL。

    2.5  精密度考察

    取同一对照品溶液进样6次， 10 μL，测定峰面积，RSD值为0.88%，结果表明仪器具有良好的精密度。

    2.6  重复性试验

    取同一批号的样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪器。测定峰面积,根据线性回归方程计算含量。结果其相对标准偏差RSD分别为0.95%（n=6）。

    2.7  稳定性试验

    取同一样品溶液，在0、2、4、6、8、10 h分别进样10 μL，依法测定，6次测定的胆红素峰面积RSD分别为1.1％，表明样品溶液在10 h内相对稳定。

    2.8  回收率试验[3]

    精密量取同一批(批号：20030402)已知含量的供试品0.25 g平行6份置蒸发皿中（平均片重0.4915 g）， 分成3组，每组两份，分别加入对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL（60.0 μg/mL胆红素氯仿溶液），将溶液蒸干，按“2.2.2”项下制备，摇匀，按“2.1”项下分别进样10 μL，记录色谱图，计算胆红素的回收率。结果见表1。

    2.9  样品含量测定

    将3批不同批号的磺碇冰黄片按“2.2.2”项下方法制备，进样10 μL，测定峰面积,按外标法计算含量。结果见表2。

    3 结论

    3.1  检测波长的选择

    人工牛黄是磺碇冰黄片有效成分，具有解热、抗炎及抗感染作用，其中有效成分是胆红素、胆酸、去氧胆酸等。牛黄之贵贵在胆红素，因此选择其中的胆红素作为指标进行含量测定。胆红素易氧化，溶液颜色变绿，所以有关操作应尽量在避光条件下快速进行[4]。测定胆红素的紫外-可见光谱在450 nm有最大吸收波长，故选450 nm作HPLC法的检测波长。

    3.2  流动相的选择

    本实验比较了氯仿-乙腈-1%三乙胺溶液、氯仿-甲醇-1%三乙胺溶液、氯仿-甲醇-2%二乙胺水溶液等多种流动相系统，结果以氯仿-甲醇-2%二乙胺水溶液流动相峰形最好，分离最完全。

    3.3  溶剂的选择

    实验中曾比较过使用甲醇、乙腈、氯仿做溶剂，用甲醇和乙腈做溶剂时出现前沿峰对测定有干扰，使用氯仿柱效高，胆红素与其他组分色谱峰能很好分离。

【】
  [1] 国家药品监督管理局.国家药品标准WS-10001-（HD-0778）-2002[S].国家药典委员会，2002：1.

[2] 杨云沛，黄志东，李海生.人工牛黄及天然中胆红素的HPLC测定方法研究[J]. 天津药学,1995，7(2)：15-16.

[3] 刘文英.药物分析[M].北京：人民卫生出版社，1998：72-73.

[4] 金 华.氯芬黄敏片中胆红素的含量测定[J]. 中华实用医药杂志，2006，6(2)：11-12.