神经酰胺诱导的细胞凋亡在抗肿瘤研究中的应用
【摘要】 神经酰胺在细胞内有两条合成途径，即从头合成途径和鞘磷脂水解（分解合成）途径，大量的实验证明神经酰胺可诱导几乎所有细胞（包括肿瘤细胞）的凋亡，那是由于在细胞凋亡过程中神经酰胺作为第二信使参与细胞凋亡信号的传递。神经酰胺在细胞内的含量受到各种外界刺激物的影响，这些刺激物包括各种配体、化疗药物和物理因素等。由此可知有不少抗肿瘤或潜在化疗药物或物理因素正是利用了神经酰胺可调节细胞凋亡的特性而达到肿瘤的目的。在这里本文将着重讨论神经酰胺在抗肿瘤研究中的应用。
【关键词】 神经酰胺 鞘磷脂水解酶 鞘磷脂合成酶 葡糖神经酰胺合成酶
【Abstract】 Ceramide is generated by de novo pathway or hydrolyzed from sphingomyeline .Many studies prove that ceramide can induce apoptosis in almost any cell, including tumor cells, as a second messenger, it can transmit the apoptosis signal. Stimulus that can trigger the release of ceramide to mediate apoptosis include ligands，chemotherapy drugs , physical factors ,and so on. Some chemotherapy drugs and physical factors that can be used for anti-tumor treatment just because they can modulate the ceramide mass in the tumor cells. In this article the author will focus on studying the application of ceramide in anti-tumor treatment.
【Key words】 ceramide;apoptosis; sphingomyelinase;sphingomyelin synthase; glucosylceramide synthase
细胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，细胞凋亡的主要通路分别是死亡受体介导的凋亡途径或外在途径(death receptor- mediated pathway extrinsic pathway)和线粒体凋亡途径或内在途径(mitochondrial pathway or intrinsic pathway) ［1］ 。虽然两条凋亡通路的上游事件( up- stream activation)不同［2］, 但是它们最终都要激活共同的凋亡效应物, 即特异的胱冬酶( caspase) 。细胞凋亡受到严格调控, 在正常细胞中胱冬酶处于非活化的酶原状态, 凋亡程序一旦开始, 胱冬酶被活化, 随后发生凋亡蛋白酶的层叠级联反应, 引发不可逆的凋亡［3］。细胞表面存在大量受体，而在这些受体当中存在不少死亡受体，既可诱发细胞凋亡的受体，比如CD95、TNF受体以及DR5，这些受体在受到外界刺激后可诱发一系列的反应，从而引起上面所提到的两条主要的凋亡通路。在这个过程中受体和配体识别或细胞的应急反应所产生的第二信使具有信号递承和放大作用，并激活和细胞凋亡相关的下游分子 ［4～6］，这其中包括大家所熟悉的死亡第二信使既神经酰胺，神经酰胺可作为多种刺激的效用物，这些刺激除所提到的CD95配体、DR5配体和TNF外，还包括化疗药物、物理射线、细胞毒药物、细菌及病毒等因素。可见这些因素都可通过神经酰胺诱导细胞凋亡， 在这些因素中包括抗肿瘤或潜在抗肿瘤效果的药物和物理因素，在这里本文将对这些因素进行讨论。
1 神经酰胺的代谢特性
神经酰胺是脂类物质，其是膜“脂筏”构成物鞘磷脂（SM）的构成骨架，而“脂筏”在膜的信号传递中有重要作用；神经酰胺除了可作为膜的构成成分外，还具有其他重要的生物学活性。在过去的10年间，大量的实验证明神经酰胺（Ceramide,Cer）是鞘磷脂代谢的关键物质；是调节生命活动的关键物质，它通过作为信号传递的参与者，调控细胞的各种活动，可使细胞处于静息期、分化以及凋亡［7～9］。在细胞内刺激物（生长因子、荷尔蒙及细胞因子等）、细胞毒素、免疫因子及外界环境都可改变神经酰胺的含量［10］。改变神经酰胺在细胞内的含量最终是通过改变和神经酰胺代谢相关的酶活性达到，因此要理解神经酰胺的生物学活性，首先要了解其代谢特性。
神经酰胺的合成包括从头合成和分解合成途径见图1 ［11］，其是神经酰胺在细胞内的主要来源，同时神经酰胺还可作为前体参与其他物质的代谢，所涉及的主要酶包括：鞘磷脂水解酶（sphingomyelinase，SMase）， 鞘磷脂合成酶(sphingomyelin-synthase，SMS）、糖苷神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase，GCS）、神经酰胺合成酶（Cer-synthase）、神经酰胺激酶（CK）、神经酰胺水解酶（ceramidase）及丝氨酸棕榈油酸转移酶（serine palmitoyltransferase，STP）等。这些酶处于神经酰胺代谢途径中的不同部位或位置。同时即使在同一细胞类型中，也存在不同的异构酶活性，不同刺激存在不同靶酶或相同的靶酶，因此可诱导相同或不同的信号通路，有相同或不同的生物学反应。刺激物诱导细胞凋亡的主要机制是利用不同的方式改变细胞内神经酰胺的含量，而调节神经酰胺含量的主要途径是调节和其代谢相关酶的活性。抗肿瘤药物或抗肿瘤治疗可刺激细胞调节SMase、SMS 、GCS、CK及其他酶的活性，这些刺激主要可分为化疗刺激和物理刺激。
2 神经酰胺诱导的细胞凋亡在化疗抗肿瘤药物研究中的应用
抗肿瘤化疗药物根据其机制主要可分为：作用于细胞信号传递途径促进细胞凋亡的药物、作用于遗传物质DNA和RNA的药物和抗代谢类药物等，但作用于细胞信号传递途径药物的研究最为热门，而和神经酰胺代谢相关的抗肿瘤活性物质就是利用了其促凋亡特性，这些包括：肿瘤抗生素和细胞毒物等。
2.1 肿瘤抗生素 阿霉素是一种常用的抗肿瘤药物，其抗肿瘤作用机制是通过提高细胞内神经酰胺的量，使得对阿霉素敏感的细胞凋亡。在阿霉素抗肿瘤细胞的研究中发现，阿霉素对不敏感的HL-6没疗效，而敏感和不敏感最主要的差别是在不敏感的细胞中，在阿霉素的作用下可上调GCS的表达，而敏感的HL-6细胞则不能，GCS表达量的提高可催化神经酰胺的糖基化生成葡糖神经酰胺，这就减少了神经酰胺在非敏感的HL-6细胞内的累积［12］。也造成了HL-6对阿霉素的耐药性。为了解决肿瘤细胞对阿霉素的耐药性，Liu等利用RAN干扰技术降低GSC在对阿霉素具有耐药性的乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和结肠癌细胞内的表达，结果这些肿瘤细胞对阿霉素不再具有抗性，这也同时证明肿瘤细胞对阿霉素耐药性是通过上调GSC的表达而达到，因此要提高阿霉素抗肿瘤的效率可通过药物抑制GCS的表达［13］。RAN干扰技术不但在基础医学研究领域中应用很广，在肿瘤的临床研究中也应用很普遍。SMS和SMase是鞘磷脂循环中的两个关键的酶，SMS的活性增强将促进DAG合成，DAG是细胞生长信号传递中的第二信使，其对细胞的成活至关重要，而SMase却可促进细胞的凋亡，那是因为鞘磷脂的分解使得神经酰胺在细胞内累积，就促进了细胞的凋亡。由此可见这两个酶的相对活性决定细胞的生命活动。Separovic等利用RNA干扰技术减少SMS在淋巴瘤细胞中的表达，降低SMS的活性，减缓了鞘磷脂的合成速度，神经酰胺的含量也得到提高，在干扰后光损伤的淋巴瘤细胞明显更容易凋亡，在这个过程中caspase-3类似物的表达量有明显的提高，而SMS活性降低后神经酰胺含量也明显提高，这说明在降低SMS的活性的同时提高了神经酰胺含量，随后神经酰胺提高了caspase-3等类似物的活性，导致了细胞的凋亡［14］。
2.2 细胞毒物 镉和三氧化二砷是细胞毒物，对细胞有一定的毒性，但也可诱导细胞的凋亡。对铬离子敏感的近肾小管的细胞和U937（淋巴瘤细胞），重金属离子铬在处理细胞后，可明显提高肾小管细胞和U937神经酰胺的形成，在神经酰胺含量提高的同时，caspases-9 及-3的表达量也有明显的提高，而如果用fumonisin B1处理细胞（fumonisin B1是神经酰胺从头合成途径的抑制剂），可明显降低神经酰胺的量，MTT法检测发现细胞凋亡的比例也有明显的减低，这说明铬可通过激活神经酰胺的从头合成途径，提高神经酰胺在细胞内的含量，从而激活神经酰胺的细胞凋亡通路，诱导肾小管细胞和U937的凋亡［15,16］。镉诱导的细胞凋亡，对正常的细胞不利，但对肿瘤的治疗却是有利的，和镉一样都是细胞毒物的三氧化二砷（ATO）是治疗早幼粒细胞白血病（APL）的有效药物，同时对人T细胞白血病(ATL)也具有潜在治疗效果。ATO诱导APL或ATL细胞的凋亡和镉诱导肾小管细胞的凋亡都是由于细胞内神经酰胺出现了累积所引起，但ATO诱导ATL和APL凋亡主要是通过激活神经酰胺的从头合成途径并同时抑制GCS的活性，利用这双重作用，最终可明显提高神经酰胺的含量［17］，促进细胞凋亡。
3 神经酰胺诱导的细胞凋亡在物理疗法抗肿瘤研究中的应用
肿瘤的治疗除化疗外，还包括物理治疗，这些物理治疗包括氩氦刀靶向治疗、激光治疗和射频热凝治疗等，在这些物理治疗中有些也是利用神经酰胺诱导细胞凋亡的原理达到治疗肿瘤的目的，如物理射线和热疗等。
3.1 射线 细胞在紫外线照射或γ射线照射下，酸性SMase的活性得到提高，使得神经酰胺含量提高，促进细胞的凋亡，而在酸性SMase缺陷的细胞中则不会导致细胞凋亡，可见在这个过程中酸性SMase的激活对细胞的凋亡起着关键的作用，也正是由于细胞存在这样的应激机制，减少了皮肤癌的发生率，对机体具有保护作用［18］。另外电离辐射或X射线照射肿瘤细胞后出现了死亡，研究发现电离辐射或X射线照射细胞后，细胞在减数分裂过程中会由于DNA的损伤出现死亡，但最重要的原因则是中性和酸性SMase活性得到提高，促进细胞凋亡所致。光动力疗法(PDT)，是一种新的肿瘤方法，该法利用光敏感染料和可见光，使细胞产生氧应急反应，最终导致肿瘤细胞的凋亡，在这个过程中也是利用了神经酰胺的凋亡特性。用PDT处理淋巴瘤细胞后，神经酰胺从头合成的相关酶的活性没得到提高，但是从神经酰胺合成其他物质的活性却得到了抑制，可见PDT处理细胞后，SMS和GCS等酶的活性都受到抑制［19］，即神经酰胺衍生物的合成受到抑制，这样却累积了神经酰胺，促进了细胞凋亡。
3.2 热疗 最新的一些研究表明，放疗外加用温热疗法，对局限、没有严重并发症的晚期癌症的，比单独放疗对生化复发率的作用明显，这种热激活作用符合肿瘤临床治疗中所使用的热疗法，机制是通过提高细胞内神经酰胺的含量来达到诱导肿瘤细胞的凋亡，通过研究发现在热疗的条件下HL-60细胞中SMase和促有丝分裂原蛋白激酶(MAPKs)的活性都得到提高,SMase活性的提高（特别是酸性SMase），使得鞘磷脂发生水解，提高神经酰胺的含量，神经酰胺含量的提高，激活了MAPKs细胞凋亡通路，进而诱导了细胞的凋亡［20］。Kondo等研究也发现在HL-60中热休克蛋白可激活中性SMase来达到提高神经酰胺在HL-60的含量，正是由于神经酰胺含量的提高激活了c-jun的表达，最终导致死亡效应物caspase-3的活化，诱导了细胞的凋亡［21］。
3.3 其他 脑缺血或其他缺氧的状态中都会造成细胞的细胞死亡，也正是由于缺血或缺氧造成不少临床疾病，最典型的就是缺血性的脑死亡，以往的研究认为是细胞坏死所造成，可是Shimiz等研究却发现抗凋亡蛋白Bcl-2可以阻碍因缺血或是缺氧所造成的细胞死亡，这说明缺血或是缺氧所造成的细胞死亡不是坏死，而是凋亡所造成［22］。如果能够造成肿瘤细胞的暂时性的缺氧或缺血，那么肿瘤细胞将会出现凋亡，这将有助于抗肿瘤的治疗，这也恰好符合Yoshimura对 PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤）的研究结果，PC12细胞缺氧后激活了依赖镁离子的中性SMase，促进鞘磷脂的分解，导致神经酰胺在细胞内的含量有了明显提高，最终激活了细胞凋亡信号通路［23］。
4 细胞凋亡在肿瘤治疗中的不利因素和展望
神经酰胺除了可直接导致肿瘤细胞的凋亡外，也可诱导其他细胞的凋亡，可是如果其诱导抗肿瘤细胞的凋亡，将给抗肿瘤药物的研究和开发带来不少问题。树突细胞（DC）对肿瘤细胞具有特异性的抑制作用，同时也可加强T细胞对肿瘤细胞的杀伤，但是在肿瘤的过程中，由于肿瘤细胞分泌的一些特殊的物质可逃避免疫系统对其的监视，这是由于肿瘤细胞所分泌的物质诱导了DC细胞的凋亡，同时在DC细胞内神经酰胺的含量得到了提高，而神经酰胺的累积抑制了PI3K信号通路所介导的细胞成活，最终导致细胞的凋亡［24］。如果能够抑制DC细胞神经酰胺的合成，那么会抑制DC的凋亡，这将增强机体自身抗肿瘤作用。
由此可知神经酰胺可作为各种外界信号的第二信使，进而调节细胞的凋亡，这在抗肿瘤新药的研发和肿瘤临床治疗上有着重要的意义。因此如果我们能够进一步利用神经酰胺调节细胞凋亡的特性，同时避免其对免疫细胞或正常细胞的伤害，这将给抗肿瘤新药的研发和临床治疗带来机会。
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