中、重症呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的实验探究

【摘要】  目的 建立呼吸道合胞病毒(RSV)感染的中、重症小鼠模型。方法 36只小鼠分为实验Ⅰ组（16只）、实验Ⅱ组（16只）和正常对照组（4只）。采用RSV原液（TCID50为10-4.2/100 μl）及100TCID50RSV液分别滴鼻感染实验Ⅰ、Ⅱ组BALB/c小鼠，于感染后第3、5、7、9 d处死小鼠，进行病毒分离，病理光镜和电镜检查。结果 ①实验Ⅰ组的病毒分离阳性率明显高于实验Ⅱ组，二者相比有显著性差异（P<0.01）；②光镜下实验Ⅰ组肺泡壁明显增厚，毛细血管扩张充血，有较多的淋巴细胞浸润，以Ⅲ级炎症为主；实验Ⅱ组病变较实验Ⅰ组轻，Ⅲ级炎症面积及炎性细胞浸润支气管百分数少于实验Ⅰ组，两组间有显著差异（P<0.05）。2组病变以第5 d最重，第7 d后开始减轻。③电镜下实验Ⅰ组可见肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞及毛细血管内皮细胞肿胀，肺泡隔水肿，淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润；实验Ⅱ组病变轻于实验Ⅰ组。结论 用RSV原液可以成功地建立中、重症RSV感染的动物模型。 
【关键词】  呼吸道合胞病毒；模型
     呼吸道合胞病毒（RSV）是2岁以下婴幼儿毛细支气管炎和病毒性肺炎的主要病原之一，病情严重者可发生呼吸衰竭，甚至死亡。但是到目前为止，尚无用于RSV感染的特效药，而且其发病机制尚不清楚，因此亟须建立一个中、重症RSV感染动物模型，以研究 RSV感染导致的疾病。本实验采用不同浓度的RSV液感染小鼠，以期获得一个中、重症RSV感染模型。
    1  材料和方法
    1.1  材料  RSV?Long株及人喉癌上皮细胞系（Hep-2细胞），购自北京儿科研究所。清洁级近交系BALB/c雌性小鼠36只，6～8周龄，体重20±2 g，由解放军第四军医大学实验动物中心提供。
    1.2  方法
    1.2.1  病毒毒力滴定  将RSV-Long株滴入生长状态良好的单层Hep-2细胞（细胞浓度1×105）中，发生细胞病变后连传3代，在细胞融合病变最明显时，用力振荡细胞瓶，使细胞从瓶壁脱落，反复冻融3次，4℃离心，去除细胞散片，取上清液，采用Reed-Muench微量法滴定病毒效价，-30°C保存，用于动物接种。
    1.2.2  动物模型的建立 36只小鼠分为3组：实验Ⅰ组、实验Ⅱ组每组16只，正常对照组4只。用乙醚完全麻醉后，实验Ⅰ组经鼻缓慢滴入RSV原液（TCID50为10-4.2/100 μl），实验Ⅱ组经鼻缓慢滴入100TCID50RSV液，每侧鼻孔各0.1 ml；对照组每侧鼻孔给予0.1 ml的1640维持液。
    1.2.3  标本的采集  于感染后第3、5、7、9 d处死小鼠。无菌条件下取出肺组织，左肺一部分用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋制成切片，作HE染色观察肺组织病理改变，另一部分用4％戊二醛固定，用于透射显微镜下观察肺组织超微结构的改变；右肺置于灭菌Hank’s液中，用于病毒分离。
    1.2.4  肺组织病毒分离  无菌条件下取出的肺组织称重后用hank’s液洗2次，按10 ml/g加入Eagle液，剪碎新鲜的肺组织标本，研磨后离心5 min，收集上清，接种到Hep-2细胞中，观察细胞病变，待细胞融合病变“++”时，记录结果。
    1.2.5  光镜标本结果判定及统计学处理  做肺横切面连续切片，每隔100 μｍ取切片1张，共取3张。置网格目镜测微尺在400倍镜下，每张切片取10个视野，计数切片上肺泡炎0～Ⅳ级方格数及每张切片内全部支气管数和炎性细胞浸润的支气管数，数据取3张切片的均数。
    参照Szapiel［1］提供的肺泡炎分级， 0～Ⅳ级病变确定如下：0级为无肺泡炎；Ⅰ级为肺泡壁间质水肿，毛细血管充血致肺泡壁轻度增厚；Ⅱ级为肺泡壁中度增厚，肺泡腔变小；Ⅲ级为肺泡壁重度增厚，肺泡腔狭小或膨大；Ⅳ级为肺实变。
    计数资料用率表示，组间比较采用方差分析。  2  结果
    2.1  病毒效价：在96孔板中滴定病毒效价为104TCID50。
    2.2  肺组织病毒分离：实验Ⅰ、Ⅱ组第5 d病毒分离阳性率分别为83.3％、66.8％，第7 d分别为62.5％、40.5％，第5、7 d实验Ⅰ、Ⅱ组病毒分离阳性率相比分别有显著差异（P<0.01）。
    2.3  病理检查结果
    2.3.1  实验Ⅰ组  光镜下肺泡出现典型的间质性肺炎表现，肺泡壁明显增厚，毛细血管扩张充血，有较多的淋巴细胞浸润，肺泡腔明显狭窄（见封四图1），病变以感染后第5 d最显著，此时Ⅲ级炎症占绝大多数，炎性细胞浸润支气管数接近全部，第7 d炎症开始
减轻，第9 d炎症明显好转，以Ⅰ、Ⅱ级炎症为主，炎性细胞浸润支气管数明显减少，与实验Ⅱ组相比有显著差异（P<0.05）。见表1。
    电镜下可见肺泡Ⅰ型上皮细胞肿胀（见封四图2），形成水泡样，并坏死或脱落；肺泡隔有水肿，淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润；毛细血管内皮细胞肿胀，形成大小不等的囊泡，有的形成窗隔样裂隙，在病变严重的肺泡腔内，可见富含蛋白的渗液，各种炎症细胞和红细胞；肺泡Ⅱ型上皮细胞肿胀。
    2.3.2  实验Ⅱ组  表现为间质性肺炎，病变过程与实验Ⅰ组相似，但病变程度有所减轻，光镜下病理改变及电镜下超微结构的病变亦轻于实验Ⅰ组。见表1。
    3  讨论
    用RSV滴鼻能感染多种动物，如纯系小鼠、大鼠、棉鼠、豚鼠、雪貂和黑猩猩等。而BALB/c小鼠，由于其确定的基因，易于处理等优点，适用于免疫学、疫苗的研制等方面，被认为是研究RSV感染的最常用的动物模型［2］，人类RSV毒株经鼻滴入BALB/c小鼠后，很容易感染小鼠肺组织，而且其感染的时间进程、病理表现与人体非常相似［3］。表1  两实验组各级肺炎面积构成比及炎性细胞浸润支气管百分数比较
    建立RSV感染动物模型，要求病毒对照组有尽可能高的发病率，并且建立的模型其肺组织病变程度与正常相比要有一定的下降空间，因此筛选适当的接种病毒浓度十分重要。目前常用的造模浓度多为100TCID50RSV液，但是临床中的RSV感染轻重不一，严重者引起呼吸衰竭，甚至死亡等严重后果，因此建立中、重症的RSV感染模型有较大的临床意义。本研究采用RSV原液（TCID50为10-4.2/100 μl）及100TCID50RSV液建立模型，结果显示2组小鼠肺组织均可分离出RSV病毒，但实验Ⅰ组（RSV原液组）的病毒分离率明显高于实验Ⅱ组（100TCID50组），而且实验Ⅰ组的肺组织病变程度重于实验Ⅱ组，因此用RSV原液更适合于建立中、重症RSV感染模型。本研究显示RSV感染后3 d内病毒仅存在于上呼吸道，尚未侵及肺组织，第5 d肺组织病变最重，此时病毒复制处于高峰期，感染9 d后病变明显减轻，与以往的研究相似［4］。
    综上所述，用RSV原液可以成功地建立中、重症RSV感染的动物模型，可以用于RSV感染的发病机制及的研究。