RT?PCR法检测白血病干细胞Flt3和N?ras基因的表达
作者：徐瑞荣 王晓玲 王敬毅 崔兴 王琰
【摘要】 目的：采用逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)法检测益气养阴方及其拆方后的扶正方组、祛邪方组急性白血病干细胞Flt3和N?ras基因的表达，以期阐明Flt3和N?ras基因表达与疾病发生、的关系。方法：RT?PCR法检测中药益气养阴方组、扶正方组、祛邪方组及对照组AML患者骨髓单个核细胞Flt3和N?ras基因表达的情况。结果：Flt3和N?ras基因表达阳性率益气养阴组、扶正组、祛邪组与对照组比较，差异有显著性意义（P均＜0.01）；益气养阴组与扶正组和祛邪组比较，差异有显著性意义（P均＜0.01）;扶正组与祛邪组比较，差异无显著性意义（P＞0.05）；各FAB亚型AML间Flt3与N?ras表达阳性率比较，差异无显著性意义（P＞0.05）。结论：中药益气养阴方可降低Flt3和N?ras基因在AML细胞的表达水平，抑制AML细胞的克隆性增殖，对AML具有作用。
【关键词】 白血病干细胞 RT?PCR Flt3 N?ras
机体的造血过程复杂，受多种正负调控因子的调控。这些造血生长因子或细胞因子的调控失衡，可导致某一细胞系的过度增殖，甚至出现白血病改变。Flt3受体(fms?like tyrosine kinase receptor III,FR)是Lyman等于1993年发现的一种细胞表面酪氨酸激酶受体III( class IIIreceptor?type tyrosine kinases,RTK? III) [1]。Flt3基因是近年发现的早期造血生长因子受体基因，它与c?kit、c?fms同属于III型酪氨酸激酶家族。在70%～90%患者的白血病细胞上有Flt3过表达，而在白血病以外的肿瘤细胞中至今未有Flt3表达的报道。Flt3被认为是白血病特异性的靶分子[2～4]。Ras癌基因是一个普遍存在的真核基因家族，其命名来自大鼠肉瘤( rat sarcoma)的字首，1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒(Harvey rat sarcoma virus和Kister rat sarcoma virus)中分离出来。ras癌基因可分为N?ras、K?ras和H?ras三类，在造血系统恶性疾病中N?ras癌基因是ras癌基因突变体最高的一种，在急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia AML)中有20%～30%可出现N?ras癌基因点突变[5] 。国内外研究尚未见有关中药复方对Flt3和N?ras基因在急性白血病细胞中表达影响的研究报道。本文通过运用RT?PCR方法，检测了60例急性髓细胞性白血病病人的骨髓单个核细胞中Flt3和N?ras基因mRNA的表达，旨在阐明Flt3和N?ras基因表达与疾病发生、发展的关系，探讨中药益气养阴方治疗急性髓细胞白血病的作用机制。
1 实验材料
1.1 实验对象 2006～2007年山东中医药大学附属、山东大学齐鲁医院血液科就诊的AML初治患者60例，男35例，女25例，年龄6～56岁，中位年龄31岁。均经骨髓细胞形态学、组织化学和流式细胞术免疫分型确诊为AML。FAB分型M1型5例，M2型15例，M4型9例，M5型20例，M6型8例，M7型3例。
1.2 仪器与试剂 PCR扩增仪（HYBAID，UK）；电泳仪（DYY?Ⅲ2,北京六一仪器厂），水平电泳槽（DYY—Ⅲ32,北京六一仪器厂）；高速离心机（ALLEGRA?64R,美国BECKMAN公司）；BB16气体培养箱、HF?safe?1200型生物安全柜（上海力申仪器有限公司）；25?2型低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂）；凝胶成像仪（天能科技上海有限公司）。
Trizol( 美国Invitrogen)；氯仿；异丙醇；乙醇；DEPC（美国SIGMA公司）；引物合成（上海生工生物工程技术有限公司）;PrimeScriptTM RT?PCR Kit试剂盒（DRR014A TaKaRa）；DNAMarker(北京全式金生物技术有限公司)；Flt3、N?ras、β?actin基因引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。Flt3：L：5′?TCAAGTGCTGTGCATACAATTCCC?3′，R：5′?CACCTGTACCATCTGTAGCTGGCT?3′，186bp；N?ras：L：5′?AATCCAGCTAATCCAGAACC?3′，R：5′?TGGTCTCTCATGGCACTGTA?3′，131bp；β?actin：L：5′?AGCGAGCATCCCCCAAAGTT?3′，R：5′?GGGCACGAAGGCTCATCATT?3′，285bp。无酚红RPMI1640培养液（美国GBICO公司）；胎牛血清（杭州四季青）；淋巴细胞分离液（医学科学院血液病研究所产品）。
1.3 中药组成及制备 益气养阴方：黄芪、白花蛇舌草、小蓟、太子参、半枝莲、蒲公英、生地、黄精、女贞子、旱莲草、天冬、白术、茯苓、甘草。扶正方：黄芪、太子参、生地、黄精、女贞子、天冬、麦冬、白术、茯苓、甘草。祛邪方：白花蛇舌草、小蓟、半枝莲、蒲公英、旱莲草。
药物制备：上述三组药物由我院中药制剂实验室（国家三级重要制剂实验室）配制成1g/ml的药液，罐装于250ml输液瓶中，流通蒸汽于105℃灭菌，无菌试验阴性后用RPMI1640液（含青、链霉素各100u/ml）,正压过滤除菌，备用。
2 实验方法
2.1 骨髓单个核细胞的提取 常规无菌采集骨髓5ml，肝素抗凝;用10ml离心管，先注入5ml淋巴细胞分离液，再将骨髓液缓缓注入，使其浮于分离液上层;水平离心1800r/min，20min;将离心管垂直缓慢移入超净工作台，用毛细吸管仔细吸取中间白色悬浮层，PBS液洗2次，细胞计数。
2.2 细胞培养 骨髓单个核细胞提取后，置37℃、5%CO2 及饱和湿度的细胞培养箱中培养到对数生长期，将细胞换液。细胞混悬液分成四组：对照组加入生理盐水，实验组分别加入益气养阴方、扶正方、祛邪方中药制剂，终浓度为100μg/ml。震荡均匀，置37℃、5%CO2 及饱和湿度的细胞培养箱中继续培养48小时后冻存。
2.3 BMMNC总RNA提取 将冻存管的细胞复苏，用Trizol试剂盒按其说明书提取总RNA。抽提的RNA用DEPC?H2O溶解，测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量，按1OD 260=40μg RNARNA的浓度，OD260/280在1.8～2.0视为抽提RNA纯度很高；用2％的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳后若能看到分子量从大至小三条带：28s、18s及5s条带（但5s带一般模糊，有时消失；28s、18s带应清晰明亮，大致呈2∶1关系），视为提取出的总RNA完整性好，无降解。
2.4 RT反应 标本总RNA 2μg， Oligo DT Primer 1μl,dNTP Mixture(各10mM) 1μl,加RNase Free dH2O至10μl,在PCR仪上65℃ 反应5 min。在上述PCR管中配制反转录反应液：5×PrimerScript Buffer 4μl,Rnase Inhibitor(40U/μl) 0.5μl,PrimerScript RTase 0.5μl,RNase Free dH2O 5μl。总逆转录体系 20μl,42℃反应30min,95℃反应5min，置4℃保存。
2.5 PCR反应 反应体系为50μl,包括cDNA 3μl、10×PCR Buffer 5μl、dNTP Mixture 2μl、特异性上游引物0.5μl,特异性下游引物0.5μl、TaKaRa ExTaqHS 0.5μl,加RNase Free dH2O至50μl。将PCR小管放入PCR仪中，调整PCR仪的参数如下。Flt3:预变性94℃ 5min,变性94℃30s,退火60℃30s,延伸72℃ 45s(35Cycles)72℃ 10min;N?ras:预变性94℃ 5min，变性94℃30s，退火55℃ 45s，延伸72℃45s(40 Cycles)72℃10 min；β?actin：预变性94℃5 min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃45s(35Cycles)72℃5min。
2.6 琼脂糖凝胶电泳 反应结束后，取15μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，120V 80mA电泳35min。电泳后，在凝胶成像系统分析仪下摄片、分析。
2.7 统计学处理 结果以(±s)表示,使用SPSS13.0 统计软件包进行单因素方差分析。
3 实验结果
3.1 Flt3表达情况 Flt3基因检测阳性患者经PCR扩增后在186bp位置可发现特异性条带。60例AML患者Flt3基因表达阳性率见表1。10名正常骨髓Flt3基因检测均为阴性。表1 AML患者Flt3表达阳性率例/
3.2 N?ras基因表达情况 N?ras基因检测阳性患者，经PCR扩增后在131bp位置可发现特异性条带。60例AML患者N?ras基因表达的检测结果见表2。10名正常骨髓N?ras基因检测均为阴性。表2 AML患者N?ras表达阳性率例
3.3 各组Flt3和N?ras基因表达阳性率 益气养阴组、扶正组、祛邪组Flt3、N?ras表达阳性率与对照组比较，差异有显著性意义（P均＜0.01）；益气养阴组与扶正组和祛邪组比较，差异有显著性意义（P均＜0.01）;扶正组与祛邪组比较，差异无显著性意义（P＞0.05）;各FAB分型AML间Flt3、N?ras基因表达阳性率差异无显著意义（P＞0.05），见表3、4,图1～3。 表3 各组Flt3基因表达阳性率比较（
4 讨 论
急性白血病的主要致病因素是造血细胞的克隆扩增、分化障碍，这种分化和死亡程序及对信号分子反应的变化是基因改变的结果，其基因的产物就是一些造血生长因子受体，并在造血细胞上表达。
Flt3广泛分布表达在多种组织，如脑、胸腺、胎盘、淋巴结、脾、肝等组织。研究表明，Flt3受体以髓细胞系和单核细胞系表达率高，巨核细胞系只有少量表达，淋巴细胞只有Pro?B及Pre?B细胞表达Flt3受体，而成熟的T、B细胞不表达。Flt3基因在白血病中广泛高表达,并与疾病转归相关,有望成为白血病的泛基因。近年的研究发现，70%～100%的AML,50%以上的ALL及CML(慢性髓性白血病)加速期、急变期有Flt3高表达[6]。
N?ras癌基因是急性髓细胞性白细胞(AML)最常被检测到的基因异常，N?ras癌基因在ras基因突变中所占比例最高,白血病又以AML最常被检测到N?ras,其主要是N?ras癌基因突变,少有K?ras及 H?ras突变[7]。采用PCR技术,N?ras突变在AML中的检出率约24%[7,8]。有学者[8]认为，ras基因点突变可作为白血病细胞分子标志用于检测微量残留白血病(MRLC)。N?ras癌基因可作为AML基因突变的一个指标应用于诊断和预后判断。
本研究结果显示，Flt3和N?ras基因在AML患者表达阳性率很高。正常骨髓Flt3和N?ras表达为阴性。中药益气养阴方可降低白血病细胞Flt3和N?ras基因的表达，与扶正组、祛邪组比较，差异有显著意义（P均＜0.01)；中药益气养阴方能够降低Flt3和N?ras基因表达水平，抑制AML细胞的克隆性增殖，对AML具有作用。
【】
1 Rosnet Ｏ,Schiff C,Pebusque MJ,et al.Human Flt3/ FLK2 gene:cDNA cloning and expressin in hematopoietic cells.Blood,1993,82(4):1110?1119
2 Ozeki K,Kiyoi H,Hirose Y,et al,Biologic and clinical significance of the Flt3 transcript level in acute myeloid leukemia.Blood,2004,103(5):1901?1908
3 Meshinchi S,Woods WG,Stirewalt DI,et al,Prevalence and prognostic significance of Flt3 internal tandem duplication in pediatric acute myeloid leukemia.Blood,2001,97(1): 89?94
4 Gilliland DG,Griffin JD.The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia.Blood,2002,100(5):1532?1542
5 Farr CJ,Saiki RK,Erlich HA,et al.Analysis of ras gene mutations in acute myeloid leukemia by polymeras chain reaction and oligonucleotide probes.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85(5):1629?1633
6 Auewarakul CU,Sritana N,Limwongse C,et al.Mutations of the Flt3 gene in adult acute myeloid leukemia:determination of incidence and identification of a novel mutation in a Thai population.Cancer Genet Cytogenet,2005,162(2):127?134
7 Browett PJ,Norton JD.Analysis of ras gene mutations and methlation state in huam leukemia.Oncogene,1989,4(8):1029?1036
8 Daniel R,Jacobson,Nancy E.A highly sensitive assay for mutation ras genes and its application to the study of presentation and relapse genotypes in Acute leukemia.Oncogene,1994,9:553?563
