重型再生障碍性贫血 CD4+CD25+ 调节性 T 细胞的研究

                    作者：刘焕勋 刘鸿 古庆利 史敦云 汪新宇 邵宗鸿

【摘要】  目的：应用流式细胞术检测 SAA 患者外周血 CD4+CD25+ T 细胞、CD4+CD25high T 细胞的数量。结果：10 例初治 SAA 患者外周血 CD4+CD25+ T 细胞占 CD4+ T 细胞的（6.23±1.82）%，明显低于正常对照组（9.20+2.95）%（P < 0.01），CD4+CD25high T 细胞比例为（1.02±0.11）%，亦明显低于正常对照组（1.43±0.41)%；10 例造血恢复 SAA 患者 CD4+CD25+ T 细胞和 CD4+CD25high T 细胞比例分别为（8.92±1.22）% 和（1.41±0.64）%，与正常对照组无明显差异（P > 0.01）。认为 CD4+CD25+、CD4+CD25high T 细胞水平与 SAA 密切相关。

【关键词】  重型再生障碍性贫血；CD4+CD25+；CD4+CD25high

 1995 年 Sakaguchi 等[1]首次分离了 CD4+CD25+ 调节性 T 细胞亚群，并证实它具有抑制其他 T 细胞活化的功能。Baecher 等[2]报道正常人外周血中高表达 CD25 的 CD4+ 调节性 T 细胞（CD4+CD25high），其特性与小鼠血液中的 CD4+CD25+ 调节性 T 细胞相同。调节性 T 细胞与 SAA 发病的关系国内外少见报道。为此，我们用流式细胞术检测了初发病和造血恢复SAA 患者外周血 C D4+CD25+  T  CD4+CD25high 调节性 T 细胞水平，初步探讨该调节性 T 细胞与 SAA 的关系。

    1    资料与方法

    1.1    临床资料    选取深圳市第二人民和天津医科大学总医院 2004 年 1 月至 2006 年 11 月收治的 10 例 SAA 初发病患者及 10 例后造血恢复正常患者。诊断均符合标准。男 11 例，女 9 例，平均年龄 31 岁（16~49）岁；正常对照 10 例，为健康志愿者，男 9 例，女 7 例，平均年龄 28 岁，均无肿瘤及自身免疫性疾病史。

    1.2    方法    抗体有 FITC 标记的鼠抗人 CD4，CD25、CD3 抗体，PE 标记的 C D25，同型对照抗体为 PE 标记的鼠抗人 IgG1 免疫球蛋白，FITC 标记的鼠抗人 IgG1 免疫球蛋白均为美国 BD 公司产品。 流式细胞术检测人CD4+CD25+ T 细胞、CD4+CD25high T 细胞。采静脉血 2 mL，肝素抗凝，两倍体积 PBS 稀释，采用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞（PBMNC），调整细胞密度至 1×107/mL，各取PBMNC 悬液 10 UL 于标本试管中，分别加入 FITC 标记的 CD4 和 PE 标记的 CD25 各 20 UL，阴性对照管加入 FITC 标记的 CD4 和 PE 标记的鼠 IgG1 各   20 UL ，室温避光孵育 20 min，加冷 PBS 洗涤 1 次，重新悬浮细胞后上流式细胞仪检测，检测结果分别以 CD4+CD25+ T 细胞、CD4+CD25high T 细胞占 CD4+ T 细胞的百分率表示。以 CD4+ T 细胞中表达 CD25+ 荧光强度 > CD4- T 细胞中 CD25+ 荧光强度者定义为 CD4+CD25high T 细胞。

    1.3    统计学处理    应用 SARS6.12 统计软件进行统计学分析，数值用 x±s 表示，验证两样本资料符合正态分布且分差齐性后采用 T 检验比较两组间差异。

    2    结    果

    初治 SAA 患者外周血 CD4+CD25+ T 细胞、CD4+CD25high T 细胞的表达 10 例 SAA 患者中CD4+CD25+ T 细胞、CD4+CD25high T 细胞占 CD4+ T 细胞的比例分别为：（6.23±1.82）%、（9.20±2.95）%，10 名正常对照组中 CD4+CD25+ T 细胞、CD4+CD25high T 细胞占 CD4+ T 细胞的比例分别为（1.02±0.11）%、（1.43±0.41）%；两组比较差异有统计学意义（P 值均 < 0.01）。

    SAA 患者造血恢复正常后外周血中 CD4+CD25+ T 细胞、CD4+CD25high T 细胞的表达 10 例 SAA 患者血象正常后 CD4+CD25+ T 细胞、CD4+CD25high T 细胞占 CD4+ T 细胞的比例分别为：（8.92±1.22）%、（1.41±0.64）%，与正常对照组比较差异无统计学意义（P 均 > 0.1）。

    3    讨    论

    目前认为 SAA 发病与 Th1 细胞功能亢进，T 淋巴细胞自身免疫耐受被打破，TNF -α、IL-2、r-IFN 等造血负调控因子分泌增多有重要关系。研究证实，CD4+CD25+ T 细胞可通过免疫抑制作用抑制自身反应性 T 细胞的活化而维持自身免疫平衡。在一些自身免疫性疾病如 SLE、I 型糖尿病、重症肌无力、多发性硬化，特发性血小板减少性紫癜等患者中均发现 CD4+CD25+ T 细胞存在数量和功能的减低[3]。本研究发现，SAA 患者发病初期，外周血 CD4+CD25+ T 细胞和 CD4+CD25high T 细胞水平均明显减低，而后造血恢复的患者，CD4+CD25+ T/CD4+CD25high T 细胞水平接近正常，说明该类 T 细胞与 SAA 的发病有一定相关性。可能的机制为：CD4+CD25+ T、CD4+CD25high T 细胞可以通过分泌免疫调节因子（主要有 IL-4、IL-10 和 TGF -β）调节 Th1/Th2T 细胞群的来控制自身反应性T细胞和直接对效应T细胞产生作用，当体内CD4+CD25+ T、CD4+CD25high T 细胞群比例改变时，会引起它分泌的细胞因子失衡，从而导致 Th1/Th2T 细胞群比例失调，同时体内 CD4+CD25+ T、CD4+CD25high T 细胞的减少，其抑制 IL-2 产生的能力下降，维持免疫耐受的能力降低，导致体内自身活化性 T 细胞大量增殖，CD4+/CD8+T 细胞群比例严重紊乱，体液免疫亢进，导致 SAA 的发生。

    有研究表明 1，25 二羟 D3 和霉酚酸酯可以通过提高脾脏和淋巴结中 CD4+CD25+ T 细胞的比例，有效地治疗包括 ITP 在内的自身免疫性疾病。它们是否可通过调节 CD4+CD25+ T 细胞的水平用于 SAA 患者的治疗，以及 SAA 患者体内 CD4+CD25+ T 细胞数量与造血副调控因子 IL-2、TNF -α、γ- IFN 水平的关系等有待进一步研究。

【】
  〔1〕Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunologic self-tolearance maintained by actibated T cell expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Break down of a single mechanism of self-tolearace causes various autoimmune diseases〔J〕. J Immunol, 1995, 155(3):1151-1164

〔2〕Baecher-Allan C, Brown J A, Gordon J, et al. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood〔J〕. J Immunology, 2001, 167(3):1245-1253

〔3〕伏瑞祥, 吴德沛. CD4+CD25+ T 细胞在ITP发病中的作用〔J〕. 免疫学杂志, 2004, 24(1):27