人类 HLA-DP 基因多态性与溃疡性结肠炎相关性研究

                作者：郭海建 刘若丹 周向京 刘新民 刘俊 熊鹰 王建平 胡银清

【摘要】  目的：从基因水平探讨溃疡性结肠炎（UC）的发病机制，并分析其与抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）及疾病分型的关系。方法：用间接免疫荧光法分 别对 86 例 UC 患者和128 例健康者进行血清 ANCA 检测 ，同时应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性核苷酸分型技术检测深圳汉族人 HLA-DPB1 基因多态性，用 PCR 技术对 HLA-DPB1 基因第 2 外显子（exon 2）进 行体外扩增 ；然后用 Ban II、Fok I、Dde I、Rsa I、EcoN I、BstUI 6 种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，电泳分离酶切片段 ，根据片段格局 确定相应基因型别。结果：UC 患者 ANCA 的阳性率为 53.5%，对照组均为阴性；UC 患者 HLA-DPA1 等位基因频率（0.49）与对照组（0.18）比较 ，差异有 显著性（P = 0.0032，RR = 5.681， Pc = 0.033)。结论：HLA-DPA1 和 ANCA 在 UC 中阳性率均显著增加 ， HLA-DPA1 与溃疡性结肠炎有一定关联 ，溃疡 性结肠炎患者与正常人之间存在着免疫遗传异质性的差异。

【关键词】  溃疡性结肠炎；抗中性粒细胞胞浆抗体；HLA-DPA1 基因；聚合酶链反应；限制性片段长度多态性

    〔Abstract〕    Objective     To  study  HLA-DPA1  genotyping  and  to  analyze  the  relationship  among  HLA-DP  genotyping、antineutrophil  oplasmic  antibodies  (ANCA)、clinical  classification  of  ulcerative  colitris  (UC).   Methods  Eighty-six  UC  patients,  128  healthy  subjects  (HS)  were  enrolled,  and  serum  ANCA  with  indirect  immunoflorecence  and  HLA-DPAl  genotypes  were  examined  in  86  patients  with  ulcerative  colitis  and 128  healthy  controls.  HLA-DPAl  typing  was  carried  out  by  digesting  the  locus  specific  polymerase  chain reaction  amplified  products  with  alleles  specific  restriction  enzymes  (PCR-RFLP),  Ban  II,  Fok  I,  Dde  I, Rsa  I,  EcoN  I,  BstU  I.   Results      Positive  rate  of  ANCA  in  UC  patients  was  53.5%.  But  0.0%  in  HS. The  allele  frequency  of  DPA1  genotyped  by  polymerase  chain  reaction  with  sequence  specific  primers. When  UC  patients  were  divided  into  ANCA  positive  and  negative  groups,  it  is  found  that  DPA  gene  positive  rate  was  significandy  higher.    Conclusion     In  China  the  positive  rate  of  HLA-DPA1  and  ANCA  is significantly  increasing  in  patients  with  ulcerative  colitis.

    〔Key  Words〕     Ulcerative  Colitis ;  ANCA  HLA-DPAl  gene;  Polymerase  chain  reaction;  Restrictedfragment length  polymorphism

    溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种病因不十分明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病。发病机制复杂，与遗传 、免疫 、环境等因素有关 。西方国家流行病学的系列研究已强烈提示遗传因素在其发病中起重要作用。人类白细胞抗原（HLA）分型与 UC 的关系国内、外早有报道 ，但结果不一 ，可能与种族背景、病例选择及研究样本大小等因素有关[1]。已有资料表明 HLA-DP 基因多态性与多种自身免疫性疾病相关[2]，但鲜见该基因多态性与 UC 的相关性研究。我们选择 HLA-DP 基因多态性，并分析其与抗中性粒细胞胞浆抗体（arttineutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA）、临床分型的关系，以了解该病的遗传易感性以及免疫学发病机制。

    1    材料与方法

    1.1    研究对象    UC 86 例，男 50 例 ，女 36 例，平均年龄为 41.4 岁 ，来 自 2002 年 1 月到 2006 年 12 月本院住院和门诊患者 ，经临床 、实验室 、放射学 、内镜及组织学检查综合性诊断。诊断标准参照 2001 年中华医学会消化病学分会“对炎症性肠病诊断规范的建议”[3]。均接受结肠镜检查。诊断部位分远端直肠炎（含直肠及直乙状结肠），左半结肠炎和全结肠炎。初发型 36例，慢性复发型 31 例 ，慢性持续型 19 例； 轻度 35 例 ，中度 28 例，重度 23 例；远端直肠炎 27 例 ，左半结肠炎 32 例，全结肠炎 27 例；活动期 75 例，缓解期 11 例。对照组 128 例，男 71 例，女 57 例， 平均年龄为 35.1 岁，为无自身免疫疾病及遗传性疾病家族史的志愿者。所有研究对象均为汉族 。

    1.2    标本采集    空腹采取静脉血 7 mL，其中 2 mL 放入干燥管作 ANCA 测定，5 mL 加入 EDTA 抗凝管作 HLA-DP 基因分型。

    1.3    ANCA 测定    采用间接免疫荧光法，药盒购自北京协和检验科荧光免疫室 ，按说明书进行操作 ，每次实验均设阳性和阴性对照，结果由 3 人判断。

    1.4    HLA-DP 基因分型    用酚-氯仿提取 DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性核苷酸分型技术（PCR-RFLP）进行分析。HLA-DP 分型液（含有 PCR 缓冲液，dNTP，特异性引物和内对照引物以及多种内切酶）购自美国 G&T 公司，按扩增片段长度指定 DPA 特异性和 DPA 等位基因。

    1.5    统计方法    ANCA 和 HLA-DP 基因分型率的比较 ，用 SPSS 11.0 软件包进行     检验 ，当 n < 5 时用 Fisher 精确概率检验法，以 P < 0.05 为差异有显著性。

    2    结    果

    2.1    ANCA    UC 中 46 例 ANCA 阳性，阳性率为 53.5%，其中 7 例胞浆型（c-ANCA）阳性 ，39 例核周型（p-ANCA）阳性，128 例对照组均为阴性。 因 c-ANCA 例数太少 ，将它与 p-ANCA 合并一起分析。

    2.2    HLA-DP 基因分型    UC DP 基因阳性率显著高于对照组。见表 1。

    2.4    UC 临床分型与 HLA-DPA 及 ANCA 的关系    UC 的病情程度 、分期及病变部位与 HLA-DP 基因分型及 ANCA 阳性率无关（资料未列出），但 UC 的临床分型与 HLA-DP 基因分型有关，慢性持续型的 DP 基因阳性率（83.9%）较其他两型明显增高（初发型为 51.2%；慢性复发型为 50.8%，P < 0 .05）。

    3    讨    论

    UC 发病呈家族群集现象，与患者有血缘关系亲属发病率高于普通人群 ，而其配偶发病率不高，单卵双胎患溃疡性结肠炎的一致性明显高于双卵双胎，不同种族发病率不同，这些都支持 UC 与遗传有关[2]。寻找 UC 易感基因是目前研究的热点。ANCA 是一类直接作用于中性粒细胞胞浆成分的自身抗体，检出率为 50%~80%，主要是 p-ANCA。我们检测 UC 患者血清中 ANCA 阳性率为 53.5%，与多数报道一致。国外多数研究提示，UC 血清ANCA 阳性率与疾病活动性、严重程度、疾病缓解与否、手术与否及患者的性别、年龄无关[3]。其亲属阳性率高于普通人群。故认为 ANCA 可能是一种遗传学标志[4]。本研究结果支持这一观点 。

    HLA 复合体位于人第 6 对染色体的短臂上，它编码的基因及其产物在免疫和炎症反应中发挥重要作用，连锁分析发现，与炎症性肠病有关联的位点就在 MHC（主要组织相容性复合体）基因簇附近[5]。研究报道，HLA 系统的 6 种抗原 HLA-A、B、C、DR、DQ 和 DP 及其基因位点都或多或少与 UC 相关，但进行得最广泛和深入的是 HLA-DR 抗原及基因位点的研究。研究焦点基本在 DR1~DR4 几个抗原和基因位点上 ，而 HLA-DP 基因多态性与 UC 的相关性研究鲜见报道。本研究发现，UC 的 DP 基因携带者明显增加，与人种和地域相近的日本人相似，亦和上述的分析结果相一致，提示人 UC 亦与 HLA-DP 基因相关联[6]。

    研究发现，UC 与 HLA I 类抗原及 HLA-DP 抗原无关，但将 UC 分为 ANCA（+）和 ANCA（-）两种亚型后，ANCA（+） UC HLA-A19，DR2，DR15 抗原频率升高。而  ANCA（-）UC 则无此关系，故认为与 ANCA 有关的遗传学标志可能为 HLA-DPA 19，DR2，DR15[7]。另有研究发现，ANCA（+）UC 与 HLA-DP 基因有关。而ANCA（-）UC 与 HLA-DP 基因无关[8]。本研究发现，无论 ANCA 阳性或阴性。UC 的 HLA-DP 基因携带者均显著高于对照组， ANCA（+）组的 DP 基因携带者明显增加，而 ANCA（-）组则 DP 基因携带者则减少。提示我国 UC 中 ANCA 阳性和阴性 HLA-DP 的亚基因位点是不同的，其意义尚待研究。

    HLA-DP 不仅是 UC 的重要易感基因，而且可能影响疾病表现 ，有报道曾手术的 UC DRB10103 基因频率明显增加 ，有肠外表现或病变广泛者，其DRB10103 基 因 频 率 更高[9]。全结肠炎患者 DRBI 1052 和 DRw 11 基因频率比左半结肠炎和直肠炎高，难治性 UC 的 DRBI 1052 和 DRw 11 基因频率增高[10]。本研究发现，慢性持续性 UC 的 HLA-DP 基因携带者明显增加 ，提示 HLA-DP 可能会影响疾病表现。

    HLA 是迄今人类最具有多态性、最为复杂的遗传系统。HLA 的多态性显示了遗传背景的多样性和复杂性。它是人类在进化过程中抵御不良环境因素的一种适应性表现，对维持种群的生存与延续有重要的生物学意义。因此，人类 HLA 的分布有显著的人种、民族和地理差别。这可以解释为什么不同人种的常见疾病不尽相同，以及为什么同种疾病在不同地区、不同人种中会有不同的 HLA 易感基因。我们的结果与国外报道不尽相同，分析除了受检测方法、样本大小影响外，更与 HLA 的多态性在不同的种族、地区人群中差别有关。因此，有必要在多个不同人群中进行调查。其次，由于某些 HLA 等位基因频率较低，故样本量过小难免造成实验误差。而且，UC 的发病机制是多方面的，仅就免疫因素而言，可能也是多相关基因所致，因此，在加大样本的基础上还需进行 UC 家系的 HLA 基因的调查研究。

【】
  〔1〕 Stokkers PC, Reitsma PH, Tytgat GN, et al. HLA-DR and DQ phenotypes in infl~ammatory bowel disease:amet–analysis〔J〕. Gut, 1999, 45:395-401

〔2〕 吴琳, 黄象谦, 王绪彝, 等. HLA A、B与溃疡性结肠炎的关系〔J〕. 中华消化杂志, 1994, 14:244-245

〔3〕 中华医学会消化病学分会. 对炎症性肠病诊断规范的建议〔J〕. 中华消化病杂志, 2001, 21(4):236-239

〔4〕Hertervig E, WiesLander J, Johnson C, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in chronic inflammatory bowel disease: Prevalence and diagnostic role . Scand J Gastroenterol, 1995, 38:693-698

〔5〕 Silverberg MS, Steinhart AH, McLed RS, et a1. Evidence for finkage between Crohn’s disea and a locus near the major histocompatibility complex on chromosome 6 in a Canadian inflammatory bowel disease population〔J〕. Gastroenterology, 1999, 116:A820

〔6〕 Futami S, Aoyama N, Honsako Y, et al. HLA DRB1’1502 allele subtype of DR15 is associated with susceptibility to ulcerative colitis and its progression〔J〕. Dig Dis Sci, 1995, 40:814-818

〔7〕 Perri F, Annese V, Piepoli A, et al. HLA antigens and p-ANCA define ulcerative colitis as a genetically heterogeneous disorder. Ital J Gastroenterol Hepato1, 1998, 31:56-6l

〔8〕 Yang H, Rotter JI, Toyoda H, et al. Ulcerative colitis:genetically hetretogeneous disorder defined by genetic (HLA classⅡ) and subclinical (antineutrophil cytoplasmic antibodies) markers〔J〕. J Clin Invest, 1993, 92:1080-1084

〔9〕 Roussomoustakaki M, Satsagl J, Welsh K, et al. Genetic markers may predict disease behavior in patient with ulcerative colitis〔J〕. Gasttruenterology, 1997, 112:11845-1853

〔10〕Masuda H, Nakarnura Y, Tanaka T, et al. Distinct relationship between HLA-DR genes and intractability of ulcerative colitis〔J〕. Am J Gastroenterol, 1994, 89:1957-1962