小续命汤对急性缺血性中风模型大鼠血浆一氧化氮和一氧化氮合酶的影响

【摘要】  目的：观察小续命汤对急性缺血性中风模型大鼠血浆一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活力的影响，探讨其在急性缺血性中风中的作用机制。方法：应用线栓法制备大鼠急性脑梗死模型，给予中药小续命汤灌胃 10 d 后，测定血浆中 NO 含量和 NOS 的活力。结果：中药治疗组血浆 NO 含量和 NOS 活力明显下降，与模型组相比差异显著（P < 0.01）。结论：中药复方小续命汤可降低急性脑梗死大鼠血浆 NO 含量和 NOS 的活力，抑制缺血性脑损伤。

【关键词】  急性缺血性中风；中药小续命汤；NO；NOS；实验研究

    〔Abstract〕    Objective     To  observe  the  change  of  the  level  of  nitric  oxide  (NO)  and  the  activity  of nitric  oxide  synthase  (NOS),  and  to  discuss  the  mechanism  of  curing  function  in  the  acute  cerebral  infarction(ACI).    Methods     Using  suture  methods  to  induce  rats  mode  of  acute  cerebral  infarction,  giving  a  certein Xiaoxuming  decoction  by  intragastric  administration.  And  determinting  the  level  of  NO  and  the  activity  of  NOS.    Results     There  were  the  reduction  of  the  level  of  NO  and  the  activity  of  NOS  in  treatment  group.  Compared  to  model  group,  there  were  significant  difference  (P  <  0.01).     Conclusion     Traditional  Chinese  medicine  of  Xiaoxuming  decoction  can  lower  the  level  of  NO  and  the  activity  of  NOS  obviously.  It  can  suppresses  the  ischemic  brain  damage.

    〔Key  Words〕    Acute  ischemic  stroke;  NO;  NOS;  Experimental  study

    急性缺血性中风是急性脑血管病，其病因及诱发因素较多，但与免疫学的关系已逐渐受到重视。 NO 是近年来发现的一种具有神经元之间的信使物质作用的分子，能广泛参与和调节多种生理和病理活动，对脑缺血的病理生理改变起着非常重要的介质作用。高浓度 NO 对细胞有直接毒性作用。脑组织中 NO 介导的细胞死亡可通过坏死性和凋亡性细胞死亡两种途径。最近研究提示 NO 和 NO2- 的毒性作用主要是 ONOO- 所致，缺血中晚期（≥2 h）缺血区产生 NO，加剧损伤[1]。本研究通过制备急性缺血性中风大鼠模型，运用中医祛风助阳治疗法则，采用中药小续命汤观察影响梗死大鼠血浆 NO 和 NOS 含量的变化，探讨其可能作用机制及意义。

    1    材料和方法

    1.1    实验动物

    Wistar 大鼠，雌雄各半，月龄 12 月，体重（240±20）g，共 75 只，由广西中医学院实验动物中心提供。实验期间，动物室温度控制在 15~20℃，大鼠需于术前在实验室喂养 1 周，自由饮水、进食，术前一晚需禁食，每天清洁垫料，5 只/笼，雌雄分笼饲养。

    1.2    药物制备及试剂

    1.2.1  药物组成    （麻黄、桂枝、杏仁、人参、甘草、黄芩、广防己、川芎、白芍）各一两，附子一枚，防风一两半，生姜五两。

    1.2.2    药物制备    小续命汤按《备急千金要方》所载药物剂量比例，取常用量，然后煎煮浓缩至 1:1（即每 l mL 药液含生药 1 g）混悬液冰箱保存备用。以上药物均由广西中医学院附属第一制剂室提供。

    1.2.3    主要实验试剂    NO 试剂盒、NOS 试剂盒由江苏南京建成生物工程研究所提供。

    1.3    实验仪器

    721 分光光度仪、流式细胞仪、手术包、灭菌设备等。

    1.4    局灶性脑缺血中风大鼠模型的建立[2]

    线栓制备，取 3-0 单尼龙线 50 mm，一端加热使之成光滑球面，并在距球面 18 mm 处作标记，酒精清洁后置生理盐水中备用。10% 水合氯醛（35 mg/kg）腹腔麻醉，取颈腹侧旁正中切口，钝性分离并暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉并结扎颈总动脉和颈外动脉。于颈内动脉近端备线并打一活结，远端用微动脉夹夹闭。在右侧颈总动脉分叉部取一小切口，将与体重相应直径的栓线插入，打开动脉夹。当线端进入 17~21 mm 时感到一定阻力即可停止，扎紧备线，固定纤维缝合。假手术组做同样手术，但不阻断动脉血流[3]。

    1.5    分组及干预方法

    将 75 只大鼠随机分为假手术组（A）（只分离动脉，不结扎插线）15 例，造模组（B）15 例；实验组低剂量组（C）15 例，中剂量（D）15 例，高剂量（E）15 例。①实验组：按照《中药药理研究方法学》上的剂量估计换算方法，取人的常用量，算得 200 g 大鼠对应于人的常用剂量为 3 mL/d，即作为低剂量组（C）的剂量；中剂量（D）为常用量的 2 倍，即 6 mL/d；高剂量（E）为常用量的 4 倍，即 12 mL/d。各给药组均于造模后 3 h 后进行中药灌胃治疗，3 次/d，连续 10 d。②假手术组和模型组术后分置普通笼中养，1 g/100 g 体重盐水灌胃，3 次/日，连续 10 d。③各组大鼠均在 10 d 后，开胸暴露心脏，心脏取血 3 mL，离心制备成血清以备检测。

    1.6    观察方法

    1.6.1    动物功能评定    右侧 MCAO 后 1.5 h，大鼠已清醒。参照经典的 Zea Longa 法 5 级 4 分法[4]。0 分：无神经功能缺损症状；1 分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展对侧前爪；2 分：中度局灶性神经功能缺损，向对侧转圈；3 分：重度局灶性神经功能缺损，向对侧倾倒；4 分：不能自发行走，意识水平下降。

    造模成功标准：评分 1~3 分者。

    1.6.2   血浆 NO 测定    使用 721 分光光度仪，采用硝酸酶还原法测定。

    1.6.3   血浆 NOS 测定   NOS 催化精氨酸（L-Arg）和分子氯反应生成 NO，NO 与亲核物质生成有色化合物，在 530 nm 波长下，测定吸光度。根据吸光度大小出 NOS 活力。

    1.7    统计学处理

    采用 SPSS 11.5 软件包完成，计量资料用 x±s 表示，进行单因素方差分析（组间比较）。

    2    结    果

    2.1    中药对大鼠血浆 NO 的影响

    见表 1。

    2.2    中药治疗对大鼠血浆 NOS 的影响

    见表 2。

    3    讨    论

    中药复方小续命汤用多味入太阳经的药物平足太阳经之逆气，更以人参补气，附子、桂枝生阳、温经，芍药、川芎活血消癖，黄芩清上焦之热，如此寒热相济、消补共施，使真气自生、邪热自清、逆气得平、经络以顺、气血得行。

    有学者采用方法对这个古老的方剂进行了一系列的研究，证明了该复方中组分的活性和作用[5]。生姜在原方中用量最大，用至五两。现代研究表明：生姜对中枢神经系统有抑制作用，可显著减少人血小板标记花生四烯酸（AA）生成血栓素（BZ）及前列腺素（PG）的量，降低 PG 体内的过氧化物的形成，并强烈抑制血小板聚集作用[6，7]。生姜还能显著提高大脑总抗氧化活性以及减轻脑水肿[8]。人参、芍药、川芎，益气活血，能够改善急性缺血性中风的自由基损伤、血液流变学异常以及组织形态学的异常。目前认为复方小续命汤具有改善局部脑血流、降低脂质过氧化物的活性、防止细胞外 Ca2+ 内流，以控制、减轻脑水肿的作用；还有调整血液流变学、抑制血小板聚集显著的降脂，抗动脉粥样硬化等作用[9]。王月华[10]在复方小续命汤抗 AD 有效成分组研究中也证实了中医的“异病同治”的药基础，以及小续命汤对 AD 和脑卒中的有效成分。

    血浆中一氧化氮（NO）是在一氧化氮合酶（NOS）作用下由 L - 精氨酸氧化而成，NO 在缺血性损伤中的作用仍有争议，部分原因是因为 NO 的复杂生物学特性，对受损脑存在着利和害两方面作用。NO 作为有效的血管扩张剂和血小板聚集、白细胞黏附的抑制剂可通过增加侧支循环，阻止血小板和白细胞对微血管的阻塞而改善缺血后血流；另一方面，NO 作为一种细胞毒素可通过多种机制负面影响脑缺血。但最新报道称，NO 在缺血早期（< 2 h）可能因其促进血管扩张，抑制血小板黏附，增加半暗区血流而对组织有益，但缺血后 2 h 即无保护作用，在脑缺血中晚期随着 NOS 活性上调，产生大量 NO 导致组织损伤加重，NO 介导的细胞死亡可通过坏死性和凋亡性细胞死亡两种途径产生，NO 具有神经元之间的信使作用，介导谷氨酸等兴奋性氨基酸的细胞毒性作用，高浓度的 NO 对细胞尚有直接毒性作用。本实验显示：B 组大鼠血浆 NO 含量和 NOS 活力均有所升高，与 A 组比较，有显著差异（P < 0.05），而 C 组经小续命汤治疗后两指标均下降，与 B 组比较差异显著（P < 0.01）。C 组、D 组、E 组组间比较无显著性差异（P > 0.05），但是随着剂量的增大而表现出 NO 含量和 NOS 活力的呈缓慢下降。中药小续命汤通过降低血浆 NO、NOS 间接抑制缺血性损伤。因此说明：中药小续命汤降低大鼠脑缺血时，因 NOS 活力上调诱导性血浆 NO 的大量生成，减轻 NO 对脑细胞的毒性作用，降低 NO 大量生成引起的神经细胞死亡。这提示中药复方小续命汤具有一定临床指导意义和应用意义。

【】
  〔1〕 史树贵, 邵淑琴, 东康宁, 等. 大鼠局灶性脑缺血后NO与细胞凋亡的关系的研究〔J〕. 第三军医大学学报, 1999, 21(4):249-252

〔2〕 何秋, 刘美洁, 朴英善, 等. 栓线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究〔J〕. 医科大学学报, 1998, 27(4):343

〔3〕 戴炯, 文立. 改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型〔J〕. 上海大学学报(医学版), 2007, 27(10): 1218

〔4〕 Longa EZ, Weisntein PR, CarisoinS, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕. Strock, 1989, 20(1):84-89

〔5〕 李忠红, 倪坤仪, 杜冠华. 高效液相色谱-质谱法鉴定中药复方小续命汤有效成分组中醇溶性成分〔J〕. 分析化学研究报告, 2007, 35(2):233-239

〔6〕 何丽娅, 张雪飞, 吴和平, 等. 生姜对脑缺血再灌注损伤的总抗氧化活性的影响〔J〕. 中药药理与临床, 1996, (5):36-37

〔7〕 阴健, 郭力弓. 中药现代研究与临床应用〔M〕. 北京:学苑出版社, 1983. 253

〔8〕 叶映月, 尚锦秀, 涂晋文, 等. 小续命汤对出血性中风脑水肿作用机理探讨〔J〕. 中国实验方剂学杂志, 1999, 5(3):48-49

〔9〕 关建红, 王世民. 小续命汤降脂作用初探〔J〕. 山西医药杂志, 1996, 25(4):289-290

〔10〕王月华, 杜冠华. 复方小续命汤抗AD有效成分组研究〔J〕. 中成药, 2005, 9(27):995