低氧环境下三氧化二砷对人肺癌细胞增殖和凋亡的作用
作者：沈捷, 曲歌平, 修清玉, 李兵
【摘要】 目的：观察常氧和低氧环境下不同浓度的三氧化二砷（arsenic trioxide, As2O3）对人肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。方法：在常氧（21% O2）和低氧（5% O2）环境下对人肺腺癌细胞A549进行体外培养，采用0、1、2、4 μmol/L As2O3分别作用A549细胞12、24和48 h，甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测A549细胞增殖抑制率；膜连蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）/碘化丙啶（propidium iodide, PI）双标记法检测细胞凋亡。结果：常氧和低氧环境下，1、2、4 μmol/L As2O3均能显著抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡，且会随As2O3浓度的升高和作用时间的延长而增强；该作用在两种环境下的差异无统计学意义。结论：As2O3可抑制A549细胞增殖和促进细胞凋亡；在低氧环境和常氧环境下对A549细胞具有同样的细胞毒性作用。
【关键词】 砷化合物; 低氧; 细胞凋亡; 细胞增殖; 肺癌
Objective: To observe the effects of different concentrations of arsenic trioxide (As2O3) on apoptosis and proliferation of human lung cancer cell line A549 in vitro under hypoxia and normoxia.
Methods: A549 cells were treated with 0, 1, 2, 4 μmol/L As2O3 for 12, 24 and 48 h under hypoxia (5% O2) and normoxia (21% O2). The proliferative inhibition rate of A549 cells was measured with methyl thiazolyl tetrazolium assay, and the apoptotic rate of A549 cells was detected by Annexin Ⅴ/propidium iodide (PI) double staining.
Results: Under normoxia and hypoxia, 1, 2, 4 μmol/L As2O3 could significantly inhibit the proliferation of A549 cells and induce the apoptosis of A549 cells. The results depended on the drug concentration and action time. And the hypoxia couldn't influence the effects of As2O3.
Conclusion: As2O3 can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of A549 cells under hypoxia and normoxia.
Keywords: arsenic compounds; hypoxia; apoptosis; cell proliferation; lung cancer
三氧化二砷（arsenic trioxide, As2O3）可通过改变肿瘤细胞内多种信号转导途径，发挥抑制瘤细胞生长，促进瘤细胞分化，阻滞血管形成等细胞毒性作用［1?3］。我国首先将As2O3应用于急性早幼粒细胞白血病的，进而研究发现它对多发性骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤及肝癌［4］、乳癌［5］、卵巢癌［6］等实体瘤也有一定疗效。有研究显示As2O3在低氧状态下仍然对一些肿瘤细胞具有杀伤作用［7?9］，但其在低氧环境下对肺癌细胞的作用仍有待进一步深入研究。
本研究将不同浓度As2O3在常氧（21％ O2）和低氧（5％ O2）环境下，分别作用于人肺腺癌A549细胞，并持续作用一定时间，观察比较两种环境下As2O3对A549的影响，了解As2O3对肺癌细胞的作用，探讨其在肺癌临床治疗上的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验材料 F12K培养基、胰蛋白酶液，购自Invitrogen公司；新生小牛血清，购自杭州四季青生物制品所；膜连蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）?FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自晶美生物公司；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）和二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）购自华美生物工程公司；As2O3由哈尔滨伊达药业有限公司惠赠；Cytomics FC 500型流式细胞仪为美国Beckman公司产品；人肺腺癌A549细胞，购自院细胞库；Genbag Microaer低氧培养袋，购自BioMerieux公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 人肺腺癌A549细胞，在37 ℃、5％ CO2饱和湿度培养箱内，用含10%小牛血清的F12K培养基传代培养，0.125％胰蛋白酶消化，待细胞生长活力良好，处于对数生长期时应用。利用Genbag Microaer低氧培养袋来构建低氧环境（5％ O2），将细胞放入低氧培养袋中密封，然后置于37 ℃、5％ CO2饱和湿度培养箱内培养。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 取常氧（21％ O2）和低氧（5％ O2）环境下对数生长期的A549细胞，分别用含As2O3 0、1、2、4 μmol/L的培养基接种于96孔培养板内培养，其中不加药组作为对照，设3个复孔，每孔细胞密度约1×104/L，总体积200 μl。在各自培养环境（常氧和低氧）下分别培养12、24和48 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT工作液20 μl，37 ℃继续培养4 h，以300 g/min离心5 min，弃上清液，每孔加入DMSO 10 μl，震荡溶解结晶，在波长490 nm处比色，据各孔吸光度（optical density, OD）值反映细胞密度，以上实验均重复3次。实验中检测的增殖抑制率按以下公式：增殖抑制率=（对照孔OD值－实验孔OD值）/对照孔OD值×100%。
1.2.3 Annexin Ⅴ/碘化丙啶双标记法检测细胞凋亡率 取常氧和低氧环境下对数生长期的A549细胞，分别用含As2O3 0、1、2、4 μmol/L的培养基接种于24孔培养板内培养，以不含As2O3组细胞为对照组，每浓度设3个复孔，每孔细胞密度约1×105/L，总体积1 ml，分别在常氧和低氧环境下培养12、24和48 h。收集各时间点各组实验细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液；1 500 r/min离心5 min，收集细胞；用PBS液洗涤细胞2次（1 500 r/min离心5 min），收集1×105个细胞；加入500 μl 缓冲液重新悬浮细胞；加入5 μl Annexin Ⅴ?FITC混匀后，再加入10 μl碘化丙啶（propidium iodide, PI）（20 μg/ml）混匀；避光、室温反应15 min后在流式细胞仪上进行检测。以Annexin（+）/PI（－）判断为早期凋亡细胞，Anexin（+）/PI（+）判断为晚期凋亡细胞，两种凋亡率总和为总凋亡率，以上实验均重复3次。
1.3 统计学方法 测量数据均以x±s形式记录，统计软件为SAS 6.12，各组数据采用单因素方差分析F检验，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05视为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 常氧与低氧环境下As2O3对A549细胞增殖的作用 As2O3在常氧（21％ O2）和低氧（5％ O2）环境下均能明显抑制A549细胞增殖，且作用随着As2O3浓度的提高和作用时间的延长而增强。在常氧和低氧环境下1 μmol/L的As2O3处理12 h，细胞的增殖抑制率约4%，当作用时间延长到48 h，其增殖抑制率便提高到11%左右；当As2O3浓度达到4 μmol/L并且作用48 h后，两种环境下的细胞增殖抑制率都达到30%左右。针对两种环境之间的比较发现，低氧与常氧环境下各As2O3浓度抑制A549细胞增殖作用的差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。
图1 常氧和低氧环境下不同剂量As2O3作用不同时间对A549细胞增殖抑制率的影响（略）
Figure 1 Proliferative inhibition rate of A549 cells treated with different dose arsenic trioxide for different action time under normoxia and hypoxia
2.2 常氧与低氧环境下As2O3对A549细胞凋亡的影响 常氧与低氧环境下未经As2O3处理的A549细胞在培养12、24和48 h后，其早期、晚期凋亡率和总凋亡率的差异无统计学意义，说明常氧和低氧环境下凋亡对As2O3的作用效果没有影响；不同浓度As2O3处理的A549细胞在处理12、24和48 h后，其凋亡率均显著高于未经As2O3处理的对照组（P<0.05），且经不同浓度As2O3处理后，A549细胞凋亡率的差异亦有统计学意义（P<0.05），高浓度组显著高于低浓度组，且这种凋亡主要以早期凋亡为主；同时A549经As2O3处理不同时间后，细胞凋亡率的差异亦有统计学意义（P<0.05），凋亡作用会随着As2O3作用时间的延长而增强。两种环境间对比发现，低氧环境下As2O3对A549细胞凋亡的作用与常氧环境下比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2和图3。
图2 常氧和低氧环境下不同时间剂量As2O3对A549细胞早期凋亡率的影响（略）
Figure 2 Early apoptotic rate of A549 cells treated with different dose arsenic trioxide for different action time under normoxia and hypoxia
图3 常氧和低氧环境下不同时间剂量As2O3对A549细胞晚期凋亡率的影响（略）
Figure 3 Late apoptotic rate of A549 cells treated with different dose arsenic trioxide for different action time under normoxia and hypoxia
3 讨论
肺癌是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命和健康。据世界卫生组织预计，全世界每年约有100万新发肺癌病人，我国的肺癌发病率呈直线上升。许多研究已经证实低氧是多数实体瘤微环境的特征之一，对肿瘤的、恶性侵袭和远处转移等都有极其重要的影响［10］。肿瘤组织低氧所致的低氧应激蛋白表达增加和凋亡潜能缺失均可导致肿瘤组织对化疗的敏感性降低［11，12］。肺癌属于实体肿瘤的范畴，因此寻找一个能在低氧状态下仍然保持对肺癌细胞杀伤作用的药物是研究的热点之一。
As2O3是一种新型的抗肿瘤药物，其对白血病及多种实体瘤细胞均有显著的增殖抑制作用。大量的实验资料表明，As2O3可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤组织血管增生，增加肿瘤细胞内活性氧自由基的杀伤作用等多种机制而发挥其抗肿瘤作用［13?15］。
MTT实验结果显示，As2O3在常氧（21％ O2）和低氧（5％ O2）环境下对人肺癌A549细胞都具有显著的抑制细胞增殖作用。为进一步研究细胞增殖抑制的原因，我们进行了As2O3对A549细胞凋亡的研究。我们采用Annexin V/PI双标记法来检测细胞凋亡，这种方法较观察凋亡小体的传统方法及Tunel法标记DNA断裂等方法更为敏感，它能够在细胞形态尚未出现变化之前就准确检测到细胞凋亡的早期阶段，排除了死亡细胞和损伤细胞对凋亡检测结果的干扰，并准确反映化疗药物对肿瘤的作用及效果。实验结果也明确显示，As2O3作用后，细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高，其中早期凋亡率的升高尤为明显，并且As2O3诱导凋亡的作用会随其作用浓度的提高和作用时间的延长而进一步增强，具有明显的时间?剂量?效应关系，说明As2O3可通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥对肿瘤的作用。在比较常氧和低氧环境下A549细胞的增殖抑制率和凋亡率时，我们还发现两种环境下As2O3作用的差异无统计学意义。上述结果表明As2O3是通过抑制增殖和诱导细胞凋亡来发挥对A549细胞的杀伤作用，这种作用不受低氧环境的影响。
As2O3对A549细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用，这种作用不会因为细胞的低氧环境而减弱。这预示As2O3在非小细胞肺癌的治疗上可能具有良好的前景。但As2O3低氧环境下发挥作用的具体机制仍然有待深入研究。
【】
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