缬草对慢性应激导致的抑郁大鼠大脑海马5?羟色胺水平、细胞增殖及神经元数量的影响
作者：唐久余, 曾园山, 陈巧格, 秦雅静, 陈穗君, 钟志强
【摘要】 目的：探讨缬草对慢性应激导致的抑郁大鼠大脑海马5?羟色胺（5?hydroxytryptamine, 5?HT）水平、细胞增殖及神经元数量的影响。方法：70只大鼠被分成正常对照组、未用药模型组、阴性对照模型组、阳性对照模型组和低、中、高剂量缬草组，每组10只。除正常对照组外，给予其余6组大鼠4周慢性应激建立抑郁症模型。除未用药模型组大鼠正常饲养外，其余6组大鼠在模型建立后分别灌服5%羧甲基纤维素钠、氟西汀以及低、中、高剂量缬草，灌药周期均为3周。灌药结束后，体内注射5?溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine, BrdU）标记海马增殖细胞，应用高效液相色谱法检测海马组织5?羟色胺水平，采用形态计量学方法计数海马神经元数量。结果：与正常对照组比较，低、中剂量缬草治疗组的海马5?HT含量增加，并恢复至正常水平。灌服低剂量缬草3周后，抑郁大鼠海马BrdU阳性细胞数目和神经元数量恢复性增加至正常对照组大鼠的水平。结论：小剂量缬草能够促进抑郁大鼠大脑海马5?HT水平及细胞增殖数量恢复至正常状况，同时具有保护海马受损伤神经元的作用。
【关键词】 缬草; 抑郁症; 应激; 海马; 5?羟色胺; 大鼠
Objective: To explore the effects of Valerian on the level of 5?hydroxytryptamine (5?HT), cell proliferation and neuron number in cerebral hippocampus of rats with depression induced by chronic mild stress.
Methods: Seventy rats were divided into 7 groups: normal control, untreated, negative control, positive control, and low?, medium? and high?dose Valerian?treated groups. There were 10 rats in each group. Except for the normal control group, depression was induced in rats by chronic mild stress. The depressive rats in the other six groups were intragastrically administered with sodium carboxymethycellulose, fluoxetine, and low, medium and high?dose Valerian, respectively for 3 weeks. After the treatment, the proliferating cells in the hippocampus were labeled by injecting bromodeoxyuridine (BrdU) in 7 groups. The content of 5?hydroxytryptamine (5?HT) in the hippocampus was detected by high?performance liquid chromatography (HPLC), and the number of hippocampal neurons was counted by morphometry.
Results: Compared with the normal control group, the levels of 5?HT in the hippocampus in the low? and medium?dose Valerian?treated groups were increased and recovered to normal level. After the administration of low?dose Valerian for 3 weeks, the number of BrdU positive cells and neurons in the hippocampus of the depressive rats were recovered to the normal status.
Conclusion: Minidose Valerian may promote the level of 5?HT and cell proliferation in the hippocampus of the depressive rats, and may play a role in saving injured neurons of the hippocampus.
Keywords: Valerian officinalis; depressive disorder; stress; hippocampus; 5?hydroxytryptamine; rats
抑郁症（depression）是一组以显著而持久的心境障碍为主要特征的综合征，为人群中最为常见的精神障碍之一。据世界卫生组织估计，到2020年，抑郁症将成为仅次于缺血性心脏病的第二大疾病［1］。到目前为止，对抑郁症的发病机制尚未明确。解释抑郁症发生的单胺类神经递质及其受体学说、海马齿状回神经发生障碍学说和海马神经元损伤学说等，只是从某一方面说明抑郁症是怎样发生的，并不能全面阐述抑郁症的发病机制。近年的研究表明，长期慢性应激可引起海马结构和生物化学的变化：一方面海马神经元发生死亡和神经发生出现障碍，另一方面海马5?羟色胺（5?hydroxytryptamine, 5?HT）水平降低，这些都可以导致海马功能下降，最终引起抑郁的发生。据认为，缬草（Valerian）具有镇静、催眠和抗抑郁等作用。Oshima等［2］报道，缬草提取物能够使抑郁小鼠的行为恢复正常状态，提示缬草具有抗抑郁活性成分。我们的研究也发现，缬草能够改善慢性应激导致的抑郁大鼠行为，证实了缬草的抗抑郁作用。本研究旨在探讨缬草对慢性应激导致的抑郁大鼠大脑海马5?HT水平、细胞增殖和神经元数量的影响，为临床应用缬草防治抑郁症提供理论依据及实验资料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 SD成年雄性大鼠70只，体质量180～200 g，由广东省实验动物中心提供，清洁级，合格证号为粤监证字2006A015。
1.1.2 药物 氟西汀购自美国礼来公司，缬草（细粉末状，为CO2超临界萃取物，不溶于水）由香港Holistal International LTD提供，氟西汀溶液和缬草悬浮液用0.5%羧甲基纤维素钠配制而成。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及模型建立 首先将80只大鼠正常饲养1周（本实验称为0周），在这段时间内，大鼠群养（每笼3～5只），且可以自由摄食和饮用自来水，同时给予1％糖水进行训练。动物房温度控制在（22±2）℃，且保持12/12 h昼夜节律。在0周结束时，对所有大鼠禁食禁水20 h，然后测定其在1 h内对1％糖水的摄取量，从中筛选出糖水摄取量相近的大鼠70只，并将其分成以下7组：正常对照组、未用药抑郁症模型组（模型组）、阴性对照抑郁症模型组（阴性对照组）、阳性对照抑郁症模型组（阳性对照组）以及低、中、高剂量缬草治疗抑郁症模型组（低、中、高剂量缬草治疗组）。本实验采用慢性应激抑郁模型［3］。制作模型的具体方法是：除正常对照组外，其余6组大鼠均给予不可预测的慢性应激4周，包括强迫游泳（8 min）、禁水（20 h）、同笼饲养（16 h）、昼夜颠倒（12 h）、打湿垫料（20 h）、45度倾斜笼子（16 h）和放置异物（7 h）等，每天随机安排上述1种以上的刺激方式。
1.2.2 给药方法 模型建立后，除模型组外，其余6组大鼠分别灌服不同的药物。正常对照组和阴性对照组大鼠灌服0.5%羧甲基纤维素钠；［4］，阳性对照组大鼠灌服氟西汀溶液2.2 mg/kg；通过我们前期的预试验，低剂量缬草治疗组大鼠灌服低剂量缬草溶液100 mg/kg；中剂量缬草治疗组大鼠灌服中剂量缬草溶液200 mg/kg；高剂量缬草治疗组大鼠灌服高剂量缬草溶液400 mg/kg。以上药物的容量均是4 ml/d，分早、晚两次灌服，每次2 ml，灌药周期为3周。模型组不灌服任何药物，正常饲养。
1.2.3 组织材料制备 在实验周期结束后将所有大鼠分成两批：第一批35只，每组5只。用1%戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，断头后置于冰盘上分离海马组织，称质量后运用高效液相色谱法（high?performance liquid chromatography, HPLC）检测海马5?HT水平。第二批35只，每组5只。腹腔注射5?溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine, BrdU）75 mg/kg，共注射4次，2 h注射一次，总注射剂量为300 mg/kg。24 h后用上述戊巴比妥钠麻醉后开胸经左心室?主动脉插管，先快速灌注生理盐水，随后灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）。将经后固定的大脑行冠状连续冷冻切片，切片始于海马嘴，每300 μm连续取2张，切片厚度分别为15 μm和40 μm。每个大脑取12张切片，分6套收集。分别用于免疫组织化学染色检测海马BrdU阳性细胞数目以及用于中性红染色检测海马神经元数目。
1.2.4 HPLC检测海马5?HT水平 样品处理：每只大鼠海马标本加0.5 ml高氯酸提取液（0.1 mol/L高氯酸，内含0.1％半胱氨酸及内标64 ng/ml）在冰浴中研磨成匀浆，18 000 r/min，4 ℃离心20 min，上清液放置于另一离心管，取20 μl进行分析。色谱条件：WATERS公司1525高压泵，HP1049A电化学检测器，检测电压0.7 mV，BDS C18色谱柱（大连依利特公司）。缓冲液：3 mmol/L庚烷磺酸钠，1 003 mmol/L醋酸钠，853 mmol/L柠檬酸，0.2 mol/L 甲基乙二胺四乙酸，pH 4.0。N?2000色谱数据工作站（浙江智能信息工程研究所）。定性分析：以样品峰的保留时间与标准峰保留时间对照定性。定量方法：以3，4?二羟基苄胺为内标物，用5?HT标准品的峰面积与内标物峰面积的比值制作标准曲线，以样品峰面积与内标峰面积的比值代入标准曲线样品含量。
1.2.5 BrdU标记及其免疫组织化学染色 将BrdU溶于含7 mol/L NaOH的生理盐水中，用前新鲜配制。按75 mg/kg腹腔内注射，分4次注射，每次间隔2 h。最后1次注射24 h后灌注、取材、切片（片厚40 μm）。BrdU免疫组化染色步骤：用0.01 mol/L PBS洗大脑切片5 min×3次，3% H2O2室温处理30 min，0.01 mol/L PBS 洗5 min×3次，50%甲酰胺和2×标准柠檬酸钠盐（standard saline citrate, SSC），65 ℃温箱处理2 h，2×SSC洗5 min×3次，2 mol/L HCl 37 ℃温箱处理30 min，0.1 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.0）洗5 min×3次，0.01 mol/L PBS 5 min×3次，1∶50正常山羊血清封闭30 min，小鼠抗BrdU单抗（Sigma, 1∶400）4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，1∶200生物素标记的羊抗小鼠IgG（博士德公司）室温反应30 min，0.01 mol/L PBS 洗5 min×3次，1∶100链霉素亲和素生物素复合物（streptavindinbiotin complex, SABC）室温30 min，DAB显色，苏木素淡染。经过染色的大脑切片行常规脱水、透明和封片。
1.2.6 中性红染色步骤 将大脑切片（片厚15 μm）浸泡于1%的中性红染液20 min后，去离子水漂洗，常规脱水、透明和封片。
1.2.7 形态计量学分析
1.2.7.1 BrdU阳性细胞计数 每例动物分别计数6张脑片上海马齿状回颗粒下层（subgranular zone, SGZ）BrdU阳性细胞数。按Kuhn等［5］的方法，将SGZ定义为颗粒细胞层内缘2个颗粒细胞宽度的区域。以6张切片上双侧海马SGZ BrdU阳性细胞总数反映该动物SGZ细胞增殖状态。
1.2.7.2 海马神经元胞体计数 低倍镜下在每张大脑切片上选择一侧海马5个方格视野作为抽样计数区域：CA1?1区、CA1?2区、CA?3区、DG?1区和DG?2区。然后在400倍下计数每张切片上5个方格视野具有细胞核的神经元胞体数目，最后计算得出每只大鼠海马所抽取的6张切片上的神经元总数目。
1.3 统计学方法 本实验中所有实验数据均用x±s表示，单因素方差分析进行统计学处理，借助SPSS 12.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 海马5?HT水平 阴性对照模型组和未用药模型组大鼠海马5?HT水平低于正常对照组（P<0.05）。氟西汀能够使抑郁大鼠海马5?HT水平明显提高，并超越正常对照组大鼠的水平（P<0.05）。低、中剂量缬草能使抑郁症大鼠海马5?HT水平提高至正常对照组大鼠的水平。高剂量的缬草不能使抑郁大鼠海马的5?HT恢复至正常对照组大鼠的水平（P<0.05）。见表1。
2.2 BrdU标记阳性细胞数目 正常对照组大鼠大脑海马出现BrdU阳性细胞，这些细胞主要位于海马齿状回的颗粒细胞层和SGZ。阴性对照组和模型组大鼠海马的BrdU阳性细胞数量明显低于正常对照组大鼠的水平（P<0.05）。但是，阳性对照组和缬草低剂量治疗组大鼠海马BrdU阳性细胞数量恢复到正常对照组大鼠的水平。缬草中、高剂量治疗组大鼠海马的BrdU阳性细胞数量却没有恢复到正常对照组大鼠的水平（P<0.05）。见表1和图1。
2.3 海马神经元计数 正常对照组大鼠大脑海马的神经元胞体主要分布在海马回（CA1区、CA2区、CA3区、CA4区）和齿状回，其胞体大且染色深，胞核染色浅。阴性对照组和模型组大鼠海马存活的神经元数目明显低于正常对照组大鼠（P<0.05）。然而，阳性对照组和低剂量缬草治疗组大鼠海马存活的神经元数目恢复至正常水平。中、高剂量缬草治疗组大鼠海马存活的神经元数目没有恢复到正常对照组大鼠的水平（P<0.05）。见表1和图2。
表1 7组大鼠海马5?HT含量、BrdU阳性细胞数目和神经元胞体数目（略）
Table 1 5?HT level, and number of BrdU positive cells and perikaryon in hippocampus in seven groups
*P<0.05, vs normal control group; △P<0.05, vs untreated group; ▲P<0.05, vs negative control group; □P<0.05, vs positive control group; ■P<0.05, vs low?dose Valerian?treated group.
图1 7组大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞细胞核（箭）（免疫组织化学染色，×100）（略）
Figure 1 BrdU positive nuclei (arrows) of hippocampal dentate gyrus in 7 groups (Immunohistochemical staining, ×100)
A: normal control group; B: negative control group; C: untreated group; D: positive control group; E: low?dose Valerian?treated group; F: medium?dose Valerian?treated group; G: high?dose Valerian?treated group.
图2 7组大鼠海马CA3区神经元（中性红染色，×400）（略）
Figure 2 Neurons of CA3 area of hippocampus in 7 groups (Neutral red staining, ×400)
A: normal control group; B: negative control group; C: untreated group; D: positive control group; E: low?dose Valerian?treated group; F: medium?dose Valerian?treated group; G: high?dose Valerian?treated group.
3 讨论
抑郁症的发病是一个极其复杂的过程，海马在抑郁症的发病中起着至关重要的作用。一般认为，抑郁症的发生与大脑海马神经发生障碍密切相关［6］。成年哺乳动物海马神经发生障碍或增加分别是导致抑郁症发生或缓解的重要因素［7，8］。海马神经发生是指位于齿状回的神经干细胞在某些因素的作用下分裂增殖，其中一部分增殖后的细胞逐渐分化为神经元，而另一部分细胞则分化为神经胶质细胞，去置换那些因凋亡而缺失的神经元和神经胶质细胞。BrdU是脱氧尿嘧啶的类似物，在有丝分裂的S期整合入DNA内。因此，BrdU可以标记处于增殖状态的细胞。海马齿状回出现的BrdU阳性细胞，一般被认为是增殖的神经干细胞［9］。
慢性应激在引起海马神经发生障碍的同时，也能造成海马神经元的损伤。Garcia［13］和Sapolsky［14］的研究表明，抑郁症动物的大脑海马颗粒神经元细胞数目减少，CA3区锥体神经元萎缩且数目减少。Lucassen等［15］发现，重度抑郁症患者在海马齿状回、CA1区及CA3区有神经元凋亡。本研究显示，抑郁大鼠海马神经元比正常大鼠明显减少，这与上述的研究结果一致。这表明，长期慢性应激可以导致大鼠海马结构的变化。应用缬草可促使抑郁大鼠海马神经元恢复性增加，并且达到正常大鼠水平，提示缬草可以保护抑郁大鼠海马受损伤神经元，减少死亡。近年的研究表明，宽叶缬草等缬草类植物有清除氧自由基，保护脑细胞等作用［16］。王云甫等［17，18］研究发现，宽叶缬草可以减轻局灶性脑缺血后海马组织的病理性损害，减少神经元的死亡，具有脑保护作用。他们认为缬草保护受损伤神经元的机制是通过抑制局灶性脑缺血所诱导的C?Fos和C?Jun的表达，从而减少缺血后海马神经元死亡。但是，缬草对抑郁大鼠海马受损伤神经元的保护作用是否与其清除氧自由基或抑制C?Fos和C?Jun的表达有关，还有待于研究证实。
通过以上分析，我们认为，一定剂量的缬草一方面通过提高抑郁大鼠大脑海马5?HT水平，促进海马神经发生；另一方面通过保护抑郁大鼠海马受损伤神经元，阻止它们死亡，从而稳定海马结构，达到缓解及抑郁症的目的。缬草究竟是通过哪些具体机制缓解和治疗抑郁症，缬草中抗抑郁的活性成分有哪些，目前尚不很清楚，需要进一步探讨。
【】
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