细胞凋亡的分子机理
【摘要】 目的 研究细胞凋亡现象发生的分子机理。方法 采用回顾的方法对细胞凋亡现象发生的分子机理进行综述。结果 影响细胞凋亡的生物学机制十分复杂，有多种因子、基因和蛋白参与细胞凋亡，如神经生长因子（NGF）、热休克蛋白（HSP）和bcl-2家族等等。结论 细胞凋亡受多种生物因子影响和调节。
【关键词】 细胞凋亡 因子 基因 蛋白
细胞凋亡（cell apoptosis）是借用古希腊语，表示细胞像秋天的树叶一样凋落的死亡方式，细胞遵循自身的程序，自己结束其生命，最后裂解为若干凋亡小体而被其他细胞吞噬。1972年Kerr最先提出这一概念。细胞凋亡是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。细胞凋亡是受基因调控的精确过程。细胞凋亡包含着极为复杂的分子生物学机制，现将就凋亡相关分子机制做一个简要。
1 细胞凋亡途径
细胞凋亡的途径主要有两条，一条是细胞表面凋亡受体介导的通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶Caspase-8，一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活Caspase-9。活化的Caspase-8和Caspase-9均可激活Caspase-3，将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡［1，2］，见图1。
1.1 表面凋亡受体Fas介导的细胞凋亡 细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的跨膜蛋白，它们包括Fas（Apo-1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1和DR5/TRAIL-R2。其配体属于TNF家族，目前已比较清楚的是Fas介导的细胞凋亡途径。
Fas具有三个富含半胱氨酸的胞外区和一个称为死亡结构域（Death domain，DD）的胞内区。Fas的配体FasL（Fas ligand）与Fas结合后，Fas三聚化使胞内的DD区构象改变，然后与接头蛋白FADD（Fasassociated death domain）的DD区结合，而后FADD的N端DED区（death effector domain）就能与Caspase-8（或-10）前体蛋白结合，形成DISC （death-inducing signaling complex），引起Caspase-8、10通过自身剪激活，它们启动Caspase的级联反应，使Caspase-3、-6、-7激活，这几种Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡［3］。
Caspase 可激活名叫CAD（caspase-activated Dnase）的核酸酶，CAD能在核小体的连接区将其切断，形成约为200bp整数倍的核酸片段。正常情况下CAD存在于胞质中，并且与抑制因子ICAD/DFF-45蛋白结合，不能进入细胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45，释放出CAD，使它进入细胞核降解DNA。
Fas介导的细胞凋亡还可能以神经酰胺作为第二信使传递信号，通过激活一系列蛋白激酶和转录因子最终激活共同信号传递通路，引起细胞凋亡，这一过程被称为神经鞘磷脂循环［4］。另外，有丝分裂原蛋白激酶（MAPA）的两个亚类JNK和EPK也可以传递Fas基因的凋亡信号［5］。
Fas/FasL系统在免疫系统中具有重要的作用，其一是参与免疫调节，活化成熟的外周T细胞主要通过Fas/FasL系统介导的细胞凋亡清除与自身抗原有交叉反应的克隆和由自身抗原激活的细胞克隆，以限制T细胞克隆的无限增殖，防止对自身组织的损伤，即产生外周免疫耐受。淋巴细胞凋亡异常导致的免疫耐受失控，是自身免疫性疾病的主要病因。其二是细胞毒T细胞（CTL）可以通过FasL诱导靶细胞凋亡，但遗憾的是，某些肿瘤细胞也可以通过这一途径诱导淋巴细胞凋亡，从而逃脱免疫监控。
1.2 线粒体介导的细胞凋亡 细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素c释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素c能与Apaf-1、Caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡体（apoptosome），然后召集并激活Caspase-3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡［6］。目前普遍认为细胞色素是通过线粒体PT孔或Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道释放到细胞质中的。
线粒体PT孔（permeability transition pore）主要由位于内膜的腺苷转位因子（Adenine nucleotide translocator，ANT）和位于外膜的电压依赖性阴离子通道（Voltage dependent anion channel，VDAC）等蛋白所组成，PT孔开放会引起线粒体跨膜电位驱散［7］和细胞色素c、凋亡因子AIF等［8］释放。Bcl-2家族蛋白对于PT孔的开放和关闭起关键的调节作用，促凋亡蛋白Bax等可以通过与ANT或VDAC的结合介导PT孔的开放，而抗凋亡类蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合，或者直接阻止Bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应。
Bcl-2家族的结构和能形成离子通道的一些毒素（如大肠杆菌毒素）非常相似。插入膜结构中形成较大的通道［9］，允许细胞色素c等蛋白质通过，这可能是细胞色素c释放的另一个途径。
在线虫中ced-3和ced-4的缺失突变抑制所有发育阶段的细胞死亡。在哺乳动物中，尽管Apaf-1基因缺失的小鼠没有caspase活化，但除了神经细胞过多外，大多数器官发育是正常的。近年来的研究发现随细胞色素c释放的蛋白还有Smac（second mitochondria-derived activator of caspase）、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）和核酸内切酶G（Endo G）。Smac能通过N端的几个氨基酸与IAPs（凋亡抑制蛋白）的BIR结构域结合，从而解除IAP对Caspase的抑制；AIF（一种依赖于黄素的一种氧化还原酶）则引起核固缩和染色质断裂；Endo G可以使DNA片段化。可见即使在Caspase不参与的情况下，由线粒体途径仍可引起细胞凋亡。
在对Fas应答的细胞中，一型细胞（type I），如胸腺细胞，其Caspase-8有足够的活性，被Fas活化后导致细胞凋亡，在这类细胞中高表达Bcl-2不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在二型细胞（type II），如肝细胞中，Fas介导的Caspase-8活化不能达到足够的水平，因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途径来放大。活化的Caspase-8将胞质中的Bid剪切，形成活性分子tBid（truncated Bid），tBid进入线粒体，导致细胞色素c释放，使凋亡信号放大。
2 凋亡相关因子
2.1 神经生长因子（nerve growth factor，NGF） NGF是典型的神经营养因子，能促进中枢神经元的分化、生长及存活。神经元发生凋亡与NGF有密切关系，剥夺细胞生长所需的NGF能激活CPP32（一种诱导凋亡的蛋白水解酶），通过凋亡机制导致神经元死亡［10］。
目前研究认为，NGF通过两种受体蛋白起作用。一种是神经生长因子低亲和力受体（LNGFR）或简称P75［11］，另一种是神经生长因子高亲和力受体（HNGFR），它是由原癌基因Trk编码的一种酪氨酸蛋白激酶受体，称TrkA［12］。P75，多数报道认为周围神经系统的感觉神经元、运动神经元及交感神经元在胚胎及生长发育时表达P75，成年期不表达；也有报道认为成年基底前脑胆碱能神经元始终有P75表达。P75的胞外部分与肿瘤坏死因子（TNF）受体、人细胞表面抗原（Fas）、Ｂ细胞抗原CD40等凋亡相关受体结构相似，其表达能促进细胞凋亡。于是NGF被认为是有促进周围神经损伤修复的功能，其作用机理可能是NGF与P75结合而阻断P75诱导神经元死亡的活性，从而阻止神经元的死亡，促进损伤神经的修复［13］。TrkA被认为是NGF的功能性受体，传导NGF的信号，促进神经再生。
在基因及蛋白水平上，有研究表明，c-myc信号传导系统激活后，如有足够的NGF持续作用，细胞可以生长并增殖；否则发生凋亡。在神经元发育过程中，NGF的存在对Bcl-2功能有促进作用，NGF不存在时Bcl-2就失活，因此推测NGF与Bcl-2相耦联是抑制细胞凋亡的途径之一，但GNF与Bcl-2之间的确切关系还有待研究和证实［14］。
此外，有实验证明NGF可减少由于缺少葡萄糖所引起的培养鼠海马隔区或皮质神经元中Ca2+的升高，在培养的交感神经元中维持Ca2+的稳定，并可影响细胞内Na+/K+浓度比，改变兴奋性氨基酸（EAA）受体对EAA的反应性，从而保护神经元免受EAA引起的损伤［15］。NGF还可调节细胞内氧化-抗氧化系统平衡。
2.2 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF） TNF家族成员有：TNF-α、LT-α、LT-β、FasL、CD40L、CD30L、CD27L、4-1BBL、OX40L、TRAIL、TRANCE、TWEAKE等。TNF家族成员都是II型跨膜蛋白，并且在C端胞膜外区有一段同源序列。多数TNF超家族的成员都有可溶性形式，这些可溶性蛋白都是由成熟膜蛋白被蛋白酶消化而形成的，并都有多聚化的倾向。有些分子的功能形式就是可溶性方式。
TNF受体家族成员有：TNFR1、TNFR2、Fas、CD40、NGF-R、CD30、TNF-RP、PV-T2、PV-A53R、4-1BB、OX40、CD27、DR3、CAR1、DR4、DR5、DR6、TRID等。除了个别成员外，TNF受体超家族的成员都属I型跨膜糖蛋白，由4个部分组成：信号肽、富含半胱氨酸的胞外区、跨膜区及胞内区。这些受体中TNFR1、Fas、NGFR、DR3、CAR1、DR4包含有死亡结构域（death domain, DD）。
当TNF家族成员与细胞膜上的相应受体结合，激活受体，可导致受体胞内的死亡区域（DD）三聚化，从而启动细胞内的Caspase信号转导通路，诱导细胞凋亡。
2.3 干扰素IFN IFN-γ可单独诱导细胞凋亡，可增强TNF诱导的细胞凋亡，还可增强Fas介导的凋亡［16］。
2.4 白细胞介素-1β转化酶（ICE） 白细胞介素-1β转化酶是新一族细胞凋亡蛋白酶，虽然目前对哺乳动物的细胞凋亡机理尚未完全清楚，但是实验表明ICE族蛋白酶为凋亡机构的主要成分，有人将ICE称为细胞凋亡“刽子手”。转染了ice基因的Rat-1成纤维细胞表达的ICE，能够诱发细胞凋亡［17］；CrmA蛋白特异地抑制ICE活性，即使在除去NGF的鸡背根节神经元也不发生凋亡，同时也能防止膜蛋白（Fas）抗体介导的细胞凋亡［18］；在哺乳动物细胞凋亡中活化的ICE族蛋白酶特异地酶解死亡底物PARP，产生85kD片段［19］。
2.5 转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β） TGF-β可直接抑制神经元凋亡，影响某些调节凋亡的基因表达，如Bcl-2家族，但对Bax无影响。在培养海马锥体神经元细胞时，TGF-β可保护细胞免受辐射诱导的细胞凋亡［20］。其机理与抑制兴奋性氨基酸的神经毒性作用、保护细胞内Ca2+稳态、促进Bcl-2表达有关。
2.6 凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1） Apaf-1被称为凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1），在线虫中的同源物为ced-4，在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1含有3个不同的结构域：（1）CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集Caspase-9；（2）ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP；（3）C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c（Apaf-2）和Caspase-9（Apaf-3）参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集Caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活Caspase-3，启动Caspase级联反应。
2.7 Ca2+ 钙离子具有神经毒性，特别是在介导细胞凋亡方面，Mcconkey［21］认为胞浆Ca2+升高通过两条途径诱导细胞凋亡，一是胞外Ca2+内流促使胞浆Ca2+持续升高，作为凋亡信号启动细胞凋亡；二是Ca2+的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始与细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。胞浆Ca2+浓度升高或分布改变诱发细胞凋亡，其作用方式主要有以下几种：信号转导方式；激活核酸内切酶方式；激活转谷氨酰胺方式。Kroemer［22］则认为，凋亡因子使线粒体通透性升高，造成线粒体膜电位和生物合成破坏，细胞的能量代谢受损，氧化呼吸链解耦联，线粒体内Ca2+释放，细胞内ROS增多，谷胱甘肽减少，从而激活核酸内切蛋白酶，使细胞内Ca2+分布改变，细胞发生凋亡。
3 凋亡相关基因和蛋白酶
3.1 bcl-2家族基因 bcl-2抗细胞凋亡的作用机理有以下几方面：（1）抑制Ca2+的释放。应用转基因方法发现，bcl-2高表达可抑制内质网释放Ca2+，故推测bcl-2对细胞凋亡的抑制作用可能与内质网中Ca2+有关。Lam等［23］亦报道钙泵特异性抑制剂TG诱导的WEH17.2等细胞凋亡可被bcl-2抑制，其原因是bcl-2抑制了钙离子的跨膜流动，提示bcl-2可通过调节细胞内钙离子来调节凋亡。然而Wei等［24］在神经元细胞中发现，bcl-2虽可抑制TG诱导的细胞凋亡，但并不能抑制TG诱导的钙离子浓度升高。（2）bcl-2通过阻止促细胞凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用。（3）细胞内抗氧化作用［25］。Bcl-2可通过抑制氧自由基而发挥抗细胞凋亡作用。以往研究表明，在去除生长因子所诱发的凋亡中，活性氧是触发细胞死亡的主要诱因；bcl-2的过度表达可减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成。Cai等［26］研究表明，bcl-2的抗氧化作用是间接的，即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧，而bcl-2的这种抑制超氧阴离子的作用与其能抑制细胞色素C的释放有关；此外还发现bcl-2能增加细胞内谷胱甘肽（GSH）等抗氧化剂，提高NAD+/NADH的比例。目前已分离出多种与bcl-2同源的家族成员，如bcl-x、bax、bad、mcl-1和BHRF-1等，它们编码的蛋白质有的抑制凋亡，有的促进凋亡，在体内bcl-2基因家族的成员通常以二聚体的形式而发挥作用，如bcl-2/bax和bcl-x抑制细胞凋亡，而bad/bax、bax/bax和bcl-2/bcl-xs则促进细胞凋亡。同一基因家族的成员何以具有两种截然不同的功能，尚有待进一步观察。
3.2 c-myc 在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有c-myc的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制分化。 在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。
3.3 P53基因 是一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其凋亡，研究发现丧失p53功能的小鼠胸腺细胞对糖皮质激素诱导的凋亡反应和正常细胞相同，而对辐射诱导的凋亡不敏感。
3.4 即早基因（immediate early genes，IEGs） 真核细胞内广泛存在C-fos，C-jun等即刻早期基因（IEGs）。Fos和jun蛋白通过亮氨酸拉链形成异源二聚体激活蛋白-1（AP-1），参与神经细胞的信息传递、生长、分化和损伤修复等。在细胞凋亡中，无论是神经元或胶质细胞，凋亡细胞的细胞核和胞质均可见选择性的c-jun的过度表达，证明C-jun在细胞凋亡中的重要作用。
3.5 APO-1/FAS Fas又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T和B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、睾丸和卵巢细胞等。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活Caspase，导致靶细胞走向凋亡。
3.6 ATM基因 ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）是与DNA损伤检验有关的一个重要基因。最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。正常细胞经放射处理后，DNA损伤会激活修复机制，如DNA不能修复则诱导细胞凋亡。ATM是DNA损伤检验点的一个重要的蛋白激酶。
3.7 Caspases家族 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点：（1）酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；（2）总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为Caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶；（3）都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。
最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族，前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner或effector），如Caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如Caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起Caspase级联反应，如Caspase-8可依次激活Caspase-3、6、7。
细胞中还具有Caspase的抑制因子，称为IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。它们能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）与Caspase结合，抑制其活性，如XIAP。
3.8 核因子NF-κB的作用 NF-κB是Rel蛋白家族成员［27］，由多肽P50和P65亚基形成P50和P65同源二聚体，其中发挥主要生理功能的是P50-P65异源二聚体。NF-κB多位于细胞胞浆中，缺血再灌注期间它可被细胞因子如TNFα、IL-1β、IL-17激活，其中过氧化物对NF-κB的激活更为重要［28］；NF-κB激活后能调节多种细胞因子的表达，如IL-6、IL-8、TNFα及黏附分子ICAM-1、VCAM-1H和ELAM-1的表达，因而具有重要的作用。NF-κB与细胞凋亡的关系尚未明确，有的认为NF-κB具有抗细胞凋亡的作用［29］，认为它能抑制Caspase-8的作用；从而能上调许多有害细胞因子的作用来看，NF-κB能促进细胞凋亡。
3.9 热休克蛋白（Heat shock protein，HSP） 热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是细胞内最重要的分子伴侣分子，除参与细胞内一些重要蛋白质分子的构象、稳定性及激酶活性调节之外，HSP另一重要生理功能是对应激状态下的细胞提供保护。近年来的研究证实HSP蛋白家族的重要成员如HSP90、HSP70及HSP27等可以直接作用于细胞的抗凋亡机制。研究表明HSP家族成员可以对凋亡体形成的不同阶段发挥阻断作用， 如HSP70可以通过阻断细胞色素c的释放、阻断Apaf-1寡聚化及阻断Caspase-9的活化等多重环节阻断凋亡体的形成［30，31］。而HSP90及HSP27则分别通过阻断Apaf-l寡聚化及直接阻断细胞色素c与Apaf-1的结合，最终阻断凋亡体的形成［32，33］。此外有证据表明HSP70还可以通过抑制凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）的功能而保护细胞免于凋亡［34］ 。AIF是位于线粒体内膜的黄素蛋白，可以通过Caspase非依赖的方式直接诱导细胞凋亡。值得注意的是HSP对凋亡体的调节是通过其分子伴侣功能来实现的［35］，提示对HSP功能的调节将直接影响其对凋亡体的调控作用。死亡受体介导的凋亡信号还可以通过由促凋亡蛋白Bid介导线粒体凋亡通路的活化，当Bid蛋白被剪切活化后可以由胞浆转移到线粒体，启动线粒体凋亡通路。新近的实验揭示Bid蛋白也属于HSP90的底物蛋白，过表达HSP90可以保护Bid免于被切割和活化，从而阻断TNF诱导的细胞凋亡。当采用HSP90功能抑制剂阻断HSP90的分子伴侣功能后，由HSP90提供的对Bid蛋白的保护随之消失［36］。
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