Survivin、Livin在脑胶质瘤组织中的表达及意义
【摘要】 目的：探讨Survivin、Livin在人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义。方法：收集52例人脑胶质瘤组织标本，另取30例正常脑组织为对照组。应用免疫组织化学方法分别检测52例脑胶质瘤组织和30例正常脑组织中的Survivin、Livin蛋白的表达，并测定52例不同病理分级的脑胶质瘤组织中Survivin、Livin蛋白表达。利用HPIAS-2000图像分析系统测定Survivin、Livin在各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。 结果：Survivin、Livin在30例正常脑组织中均不表达，而在52例脑胶质瘤组织中呈高阳性表达，两者之间差异均具有显著性（P<0.01）。图像分析结果显示，脑胶质瘤组织Survivin、Livin蛋白表达的平均光密度和平均阳性面积率均明显高于正常脑组织，脑胶质瘤组织与正常脑组织之间平均光密度和平均阳性面积率的差异有显著性（P<0.01）。Ⅲ~Ⅳ级脑胶质瘤中Survivin、Livin蛋白表达的平均光密度和平均阳性面积率均显著高于Ⅰ~Ⅱ级脑胶质瘤，Ⅲ~Ⅳ级脑胶质瘤与Ⅰ~Ⅱ级脑胶质瘤之间平均光密度和平均阳性面积率的差异亦具有显著性（P<0.05）。结论：Survivin、Livin的表达上调在人脑胶质瘤的发生、中起重要作用，并且其表达强度与脑胶质瘤的恶性程度呈明显正相关。Survivin、Livin基因可能成为脑胶质瘤基因的有效靶点。
【关键词】 Survivin； Livin； 脑胶质瘤； 免疫组化
Abstract Objective： To explore the expression of Survivin、Livin in human gliomas and its implication. Methods： Fifty-two samples of gliomas were divided into four groups by WHO standard and thirty normal brain samples were seemed as control group. All the samples were stained with SP immunohistochemistry to observe the expression of Survivin, Livin and the gliomas malignancy. Image analysis system was applied to measure the expression level of Survivin, Livin at different stage of gliomas and in normal brain tissues. Results： No positive staining was found in normal brain samples, while the expression rate in gliomas was very high. The image analysis indicated that the average optical density of Survivin, Livin protein positive immunostaining in gliomas was significantly higher than in normal brain tissues, and the positive area rate of Survivin, Livin protein positive immunostaining in gliomas was obviously higher than in normal brain tissues. Furthermore, compared with that in Ⅰ~Ⅱ degree of gliomas, the average optical density of Survivin, Livin protein positive immunostaining in Ⅲ~Ⅳ degree of gliomas increased markedly, and the positive area rate of Survivin, Livin protein positive immunostaining in Ⅲ~Ⅳ degree of gliomas increased remarkably. Conclusions： Survivin, Livin play an important role in the development of gliomas. The Survivin, Livin protein expression level increased with the degree of malignancy. Survivin and Livin were supposed to be the new targets for gene therapy of gliomas.
Key words Survivin； Livin； gliomas； immunohistochemistry
脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，其发生、发展是一个多步骤、多因素参与的过程，除了原癌基因的激活，抑癌基因的失活外，某些凋亡调控基因的异常表达也促使细胞恶性转化［1］。Survivin、Livin是新近发现的凋亡抑制基因，其表达产物具有独特的结构，能够保持特定的细胞抵抗一系列刺激原诱导，抑制细胞凋亡［2,3］。本研究采用免疫组织化学链霉素亲和素-过氧化物酶-生物素（streptavdin-peroxidase-biotin，SP）法，检测Survivin、Livin在人脑胶质瘤组织中的表达，探讨其与肿瘤发生、发展及病分级之间的关系，为脑胶质瘤的基因治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源及分组
选择我院1998年1月~2006年12月间手术切除后经病理证实的人脑胶质瘤组织标本52例，其中男32例，女20例，年龄19~67岁，平均38.6±3.5岁。按WHO病理分级，Ⅰ级12例，Ⅱ级10例，Ⅲ级15例，Ⅳ级15例。另随机选取30例同期颅脑损伤患者手术获得的无神经系统肿瘤的正常脑组织标本作正常对照，对照组男18例，女12例，年龄17~65岁，平均37.7±3.2岁。所有脑组织标本均以10％福尔马林固定，常规石蜡包埋。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂
鼠抗人Survivin单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，鼠抗人Livin单克隆抗体购自美国Imgenex公司，SP试剂盒购于北京中山生物技术有限公司，显色试盒及多聚赖氨酸购于北京中山生物技术有限公司。
1.2.2 主要仪器
YWY781型医用微波议（250W，50Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。
1.2.3 HE染色
常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及HE染色。
1.2.4 免疫组织化学SP法检测Survivin、Livin蛋白相关抗原
主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3％过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，Survivin、Livin分别采用高压抗原修复，正常羊血清处理10min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。
1.2.5 免疫组织化学结果判断
在组织切片中，细胞胞浆染为黄色至棕黄色为阳性细胞。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%）。
1.3 统计学分析
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2.1 Survivin、Livin在脑胶质瘤和正常脑组织中的表达
所有的胶质瘤显示了不同程度的Survivin、Livin蛋白表达，而在正常脑组织中Survivin、Livin表达均为阴性。图像分析结果显示，脑胶质瘤组织与正常脑组织之间Survivin蛋白表达的平均光密度分别为0.4478±0.0356、0.1135±0.0052，阳性面积率分别为0.5237±0.0402、0.1672±0.0082，脑胶质瘤组织与正常脑组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性（P<0.01）。脑胶质瘤组织与正常脑组织之间Livin蛋白表达的平均光密度分别为0.4135±0.0312、0.1123±0.0048，阳性面积率分别为0.5064±0.0388、0.1553±0.0076，脑胶质瘤组织与正常脑组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性（P<0.01）。表1 胶质瘤与正常脑组织内Survivin表达的平均光密度和阳性面积率（略）注：* 胶质瘤组与正常组比较，P<0.01。表2 胶质瘤与正常脑组织内Livin表达的平均光密度和阳性面积率（略）注：Δ 胶质瘤组与正常组比较，P<0.01。
2.2 Survivin、Livin在不同病理级别胶质瘤中的表达
图像分析结果显示，脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级中Survivin蛋白表达的平均光密度分别为0.3875±0.0321、1.1573±0.1203，阳性面积率分别为0.4256±0.0342、1.3237±0.1331，脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性（P<0.05）。脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级中Livin蛋白表达的平均光密度分别为0.3667±0.0301、1.0978±0.1102，阳性面积率分别为0.4117±0.0335、1.2826±0.1289，脑胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性（P<0.05）。Survivin、Livin表达强度随着胶质瘤病理分级升高而增加，其差异有显著性意义（P<0.05）。 表3 胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级中Survivin表达的
平均光密度和阳性面积率（略）注：* Ⅲ~Ⅳ级组与Ⅰ~Ⅱ级组比较，P<0.05。表4 胶质瘤Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级中Livin表达的平均光密度和阳性面积率（略） 注：# Ⅲ~Ⅳ级组与Ⅰ~Ⅱ级组比较，P<0.05。
3 讨论
目前普遍认为肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致，受细胞内外多种因素影响。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）是一类内源性细胞抑制因子，其过度表达引起凋亡不足与肿瘤发生密切相关［4~6］。因此，凋亡抑制基因成为恶性肿瘤分子生物学的研究热点。脑胶质瘤由于其多质性和浸润性的特点，手术切除难以完全彻底，放射治疗不敏感。化疗多产生耐药，故复发率高、预后差成为目前临床治疗的世界性难题。Survivin、Livin在人脑胶质瘤组织中的高表达反应，给胶质瘤的靶向基因治疗带来了新的思路。
Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的新成员，人Survivin基因全长14.7kb，是该家族中迄今为止发现的分子量最小、抗凋亡作用最强者。Survivin在细胞周期中呈周期依赖性表达，尤其在细胞周期的G2/M期呈高表达，能够直接抑制细胞凋亡下游终端效应器caspase-3和caspase-7，从而参与肿瘤的形成与［7］。有研究表明，Survivin在神经系统恶性肿瘤中可释放其他IAP家族的蛋白，并通过这些蛋白间接抑制caspase-3，从而间接参与肿瘤的形成和发展［8］。本研究发现，脑胶质瘤组织中Survivin蛋白表达阳性率明显高于正常脑组织（P<0.01），胶质瘤高度恶性组Ⅲ~Ⅳ级瘤组织中Survivin蛋白表达阳性率明显高于胶质瘤低度恶性组Ⅰ~Ⅱ级瘤组织（P<0.05），表明Survivin蛋白在胶质瘤中表达上调，并且其表达阳性率与胶质瘤的恶性程度呈正相关。随着胶质瘤恶性程度的增高，Survivin蛋白的表达阳性率和表达强度逐步增加，说明Survivin基因可能通过抑制肿瘤细胞的凋亡，促进细胞增殖，从而导致肿瘤细胞的增殖失控恶性化，对胶质瘤的发生、发展起着重要作用。
Livin是近年来新发现的哺乳动物凋亡蛋白抑制因子，目前对其研究甚少［9］。Livin在生理状态下，通过凋亡途径清除体内衰老和异常的细胞，有利于维持体内组织的动态平衡。Livin过度表达在肿瘤中直接或间接抑制凋亡，不仅有利于细胞的继续增殖，还有利于异常基因的进一步积聚，促使细胞恶性转化，从而有利于肿瘤的进展［10］。本研究发现，脑胶质瘤中Livin呈高阳性表达，并且Livin表达阳性率及程度随胶质瘤病理分级的升高而增加（P<0.05），提示可能通过抑制胶质瘤细胞的凋亡，对脑质瘤的生长和发展起重要的促进作用。另外，Livin在脑胶质瘤中呈高表达，而在正常脑组织中不表达，使得应用靶向Livin的基因治疗在促进肿瘤细胞凋亡同时不损伤周围正常组织细胞成为可能。
因此，Survivin、Livin在脑胶质瘤组织中的表达上调对胶质瘤的发生、发展发挥重要的促进作用，并且其表达率与肿瘤的病理分级、恶性程度呈显著正相关。尽管其具体的作用机制尚不明确，但对胶质瘤中凋亡抑制因子Survivin、Livin的表达研究，有助于理解胶质瘤的生物学特性，从而为胶质瘤基因治疗靶点的选择和进一步的临床治疗提供依据。
【】
1 邓艳春，王吉村，刘新平，等.基于PCR的消减杂交法克隆脑胶质瘤肿瘤相关基因和抑癌基因.癌症，2005，24（6）：680~684.
2 Jin Sung Jang, Kyung Mee Kim, Kyung Hee Kang, et al. Polymorphisms in the survivin gene and the risk of lung cancer, Lung Cancer, 2008, 60（1）：31~39.
3 Bin Liu, Mei Han, Jin-Kun wen, et al. Livin/ML-IAP as a new target for cancer treatment, Cancer Letters, 2007, 250（2）：168~176.
4 Zhen Xian du, Xin Meng, Hai Yan zhang, et al. Caspase-dependent cleavage of BAG3 in proteasome inhibitors-induced apoptosis in thyroid cancer cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 369（3）：894~898.
5 Yong Kee Kim, Nam Hyun Kim, Jee Won Hwang, et al. Histone deacetylase inhibitor apicidin-mediated drug resistance: Involvement of P-glycoprotein, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 368（4）：959~964.
6 David E. Burstein, Muhammad T. Idrees, Gon Li, et al. Immunohistochemical detection of the X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) in cervical squamous intraepithelial neoplasia and squamous carcinoma, Annals of Diagnostic Pathology, 2008, 12（2）：85~89.
7 Haiping Jiang, Jinming Yu, Hongbo Guo, et al. Upregulation of survivin by leptin/STAT3 signaling in MCF-7 cells, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 368（1）：1~5.
8 S. Villapol, L. Acarin, M. Faiz, et al. Survivin and heat shock protein 25/27 colocalize with cleaved caspase-3 in surviving reactive astrocytes following excitotoxicity to the immature brain, Neuroscience, 2008, 153（1）：108~119.
9 Hiroshi Kitamura, Ichiya Honma, Toshihiko Torigoe, et al. Expression of Livin in Renal Cell Carcinoma and Detection of Anti-livin Autoantibody in Patients, Urology, 2007, 70（1）：38~42.
10 Irena Crnkovic-Mertens, Thomas Muley, Michael Meister, et al. The anti-apoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of non-small cell lung cancer cells, Lung Cancer, 2006, 54（2）：135~142.
