论脑缺血氧化应激损伤及中药拮抗作用研究进展
作者：张春霞 胡利民 康立源 刘利萍 郭虹
关键词：氧化应激；脑血管病：自由基
论文摘要：氧化应激(oxidative stress，0S)是缺血性脑血管疾病重要病理反应过程。缺血性脑损伤后，活性氧自由基(oxygenflee radical，OFR)增加，通过坏死或凋亡的方式引起细胞死亡，还介导线粒体逢径、核转录因子信号转导间接导致细胞凋亡。近年来中药抗氧化应激的作用日益受到重视，有关这方面的研究也日益深入。
脑血管疾病是危害人类生命与健康的常见病和多发病，是人类三大死亡原因之一。随着当今社会的老龄化，脑血管发病率不断增高，在联合国世界卫生组织调查的57个国家中死于脑血管病者占11.3％，其中40个国家脑血管病占死因前3位，而缺血性脑血管病占很大的比例。缺血性脑损伤的病理过程极为复杂，其发病机制涉及脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、炎症反应等多环节。近些年来，氧化应激学说在缺血性脑血管疾病中的作用倍受关注。因此研究氧化应激在缺血性脑血管疾病的作用，阐明其发生机制、调节机制，对寻找临床疗效更好的药物，采取有效的防治措施有着重要意义。
1.氧化应激
1970年Paniker等首次提出氧化应激的概念。目前把能导致化学或代谢来源的活性氧(如O2、H2O2等)及相关产物产生的这一系列的细胞内或外状态，称为“氧化应激(oxidative stress，OS)”。生理条件下，这些自由基调节细胞分裂及机体免疫力，参与药物的降解、杀灭细菌。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是有氧代谢的产物，具有强氧化性，是吞噬细胞消灭入侵微生物的重要武器。当ROS的产生超过生物体的抗氧化防御能力时将导致氧化应激反应的产生。研究表明，ROS参与抵制外来物质的入侵，也充当内部生物学过程的调节因子，包括信号转导、转录或程序性细胞死亡。细胞内存在许多信号系统，这些信号系统依赖复杂的激酶级联、蛋白酶级联和(或)第二信使调节胞浆及核蛋白质，这些蛋白质再激活转录因子AP-1及核因子KB(nuclear factor-kB，NF-kB)等，调节细胞的生长和(或)凋亡。
2.脑组织对氧化应激的易感性
脑是机体代谢率最高的器官，且大部分为有氧代谢获得能量。在缺血时，特别是再灌注时，自由基的产生远远超过自身内源性抗氧化系统的清除能力。研究表明脑组织可能对氧化应激尤为易感。神经元是非再生细胞，ROS对脑组织产生的任何损伤将随着时间而蓄积。①脑组织虽然只占体重的2％，但却消耗总氧量的1/5并高频率地实现大量的ATP循环。据估计细胞消耗的氧大约5％被还原成ROS，因此脑组织与其他耗氧较少的组织相比可能产生相对多的ROS。②兴奋性神经递质如谷氨酸(Glu)的释放，在突触后神经元诱导级联反应，导致ROS的形成，这能导致神经系统局部损伤；脑缺血时，Glu大量释放的同时，其摄取受阻，细胞间液中大量谷氨酸的堆积，钙离子大量内流，引起神经细胞的肿胀、死亡。③在多巴胺能神经末稍，通过单胺氧化酶催化的多巴胺氧化过程中释放的ROS，可能增加脑组织氧化应激反应。④研究表明NO参与了CNS中神经元缺血、缺氧性损害过程。脑缺血时NO含量的改变与一氧化氮合酶(nitric oxide species，NOS)的表达有关。NOS广泛分布于脑组织，NOS有两种生化型：原生型(constitutive，eNOS)和诱生型(inducible，NOS)。eNOS的活性依赖于ca2+2/CaM，引起NO短暂释放，生物效应以细胞间信息传递为主；iNOS不依赖于Ca2+/CaM，能引起长时间NO释放，以细胞毒性作用为主。张新勇等研究发现大鼠脑缺血再灌注后神经细胞iNOS表达增强，iNOS的表达显著升高，使NOR形成增加，可能是介导脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的机制之下。
3.脑缺血后氧化应激损伤机制
3.1自由基直接损害机制 ①细胞膜损害：脂质氧化使细胞膜中的多价不饱和脂肪酸脱落；胆固醇丧失消除自由基的“清道夫”作用，膜磷脂分解，与碳水化合物结合，生物膜结构破坏，细胞崩解。②细胞器损害：自由基与酶类的共价键结合使之失活，从而损害线粒体的氧化磷酸化过程，线粒体微粒变性，能量代谢受阻。与核酸结合，使其主链断裂，透明质酸解聚，细胞死亡。
3.2氧化应激的信号转导 在缺血性脑损伤中，氧化应激不但可以直接损伤细胞，导致细胞坏死，它还可以通过介导线粒体途径、核转录因子信号转导等间接导致细胞凋亡。
①线粒体在脑缺血导致的氧化应激中的作用：有证据表明线粒体是氧化应激引起的细胞凋亡的重要通路。氧化应激可引起线粒体通透性转变孔(Mitcchondrionp erne8bili-tyt ransitionp ore，m PIP)的开放，导致许多前凋亡蛋白如细胞色素C、黄素蛋白凋亡诱导因子、核酸内切酶G等释放到细胞质中形成凋亡小体，继而激活caspmSes级联效应，最终导致程序性细胞死亡。实验证明，缺氧导致的大鼠海马锥体神经元自由基的大量产生可以被线粒体复合I阻滞剂鱼藤酮所阻断，这表明线粒体是自由基产生的主要来源。而应用线粒体钙阻滞剂只能减少部分自由基的产生。相反，应用线粒体通透性转变阻滞剂CsA完全阻滞了自由基的产生和钙的积累，并且防止了神经内膜的破坏。证明缺血后自由基在锥体神经元的产生与线粒体孔通透性改变相关。自由基可通过线粒体依赖途径，导致细胞凋亡。
最新的研究发现，由线粒体产生的O2是主要的细胞毒性物，超氧化物歧化酶SOD2过表达的大鼠可以减轻这种损伤。用含正常5倍cu-Zn SOD活性的SOD转基因鼠制作脑缺血再灌注模型并与野生鼠比较，发现转基因鼠海马CAI区、皮质、纹状体和丘脑受损神经元明显比野生鼠少。
②转录因子在脑缺血导致的氧化应激中的作用：氧化应激产生的活性氧还可以调节转录因子的活性，在细胞凋亡的信号转导中起到重要作用。1999年Dalton等证实细胞氧化还原状态由转移因子特别是核因子NF-KB的激活来调节。核转录因子NF-KB在正常细胞中与其抑制蛋白(I-KB)结合而处于失活状态，ROS可促进蛋白激酶C(PKC)的激活，活化的PKC磷酸化I-kB，导致后者与NF-kB解离，并使NF-kB活化。在SOD1过表达大鼠的脑缺血模型中，NF-kB活性明显降低。表明NF-kB参与了缺血后的氧化应激损伤。NF-kB在氧化应激中的作用，与NF-kB调节的下游靶基因包括iNOS，环氧化酶2(COX-2)，基质金属蛋白酶9CmaimmetaUoprotein-abe-9，MMP-9)等密切相关。过度表达Gu-ZnSOD的大鼠脑损伤后MMP-9和COX-2表达减少可能与脑缺血后NF-kB激活的作用有关。应用MMP抑制剂可以减少氧化应激导致的血脑屏障的损伤。NF-kB的活化是iNOS基因表达的关键环节。缺血再灌注后iNOS基因的高表达也证明了NF-kB在氧化应激的信号传导通路的重要作用。iNOS基因表达调节主要发生在转录水平上进行。但目前对于ROS如何调节NF-kB的作用机制并不清楚。
4.抗氧化应激中药研究进展
近年来的研究表明，中药及复方减轻缺血性脑损伤的主要途径之一是抗氧化应激，不少学者作了许多探索，取得了一定进展。
4.1中药复方 胥显民等研究表明，补阳还五汤能显著提高SOD的活性，降低组织丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，抑制体内LPO(U#d Immxide)生成，从而减轻氧自由基介导的脂质过氧化反应。
4.2单味中药 汤佩莲等就丹参水溶性成份对中枢神经系统缺血缺氧的保护展开了实验研究，发现丹参水溶性成分能增加脑组织的耐缺氧能力、提高机体的血氧利用率，降低机体的耗氧量和降低自由基损伤等多个途径而实现对中枢神经系统的保护。丹参亦具有拮抗低密度脂蛋白(10ndensity lipoprotein，LDL)氧化的作用，这是其对抗脑缺血损伤的机制之一。刘畅等研究表明丹参注射液可减少自由基的生成，对神经细胞的氧化损伤具有保护作用。丹参作为自由基清除剂可能通过促进缺氧缺血后脑神经细胞氧化还原因子-l(Ref-1)蛋白的表达从而抑制了细胞凋亡。陈晓春等发现黄芪能显著抑制脑缺血再灌注大鼠脑组织MDA含量的升高，提高SOD活性。熊劲等研究表明灯盏细辛明显提高缺血性卒中患者的SOD活性，降低MDA含量，灯盏细辛注射液作为一种良好的外源性氧自由基清除剂，可降低血黏度，保护细胞膜。从而降低血脂质过氧化物LPO，提高SOD含量。
4.3中药提取物 柴小立等研究表明，谷胱甘肽川芎嗪有降低缺血性脑血管病患者血LPO，提高血SOD活性的作用，前后对比，血LPO明显降低，相应的血中SOD及(glutamy lcysteiny lglyclne，GSH)明显升高。马玉羡等的研究亦得到了相似的结果，提示川芎嚷对缺氧致细胞脂质过氧化损伤有保护作用。张蕊等研究发现葛根素可减少脑组织的过氧化脂质含量，提高SOD活性，降低NOS活性，减轻自由基反应对脑组织的损害，对缺血的脑组织具有保护与复苏效应。王培源等发现葛根黄酮可减少脑缺血后脑组织水肿，缩小梗死体积，提高SOD活性，降低MDA含量，减轻自由基反应对脑组织的损害。周兰兰等发现，银杏叶提取物能明显抑制反复脑缺血再灌注小鼠脑组织MDA、NO的含量升高，并增强SOD的活性，其机制可能与抗脂质过氧化，增强抗氧化酶活性有关。甘草总黄酮能促进大鼠大脑中动脉缺血再灌注24h后，血清、脑组织中的MDA、NO含量的明显降低，血清SOD的活性提高，提示中药甘草总黄酮有抗氧化作用从而发挥脑保护的作用。蒲黄提取物可显著提高组织乳酸脱氢酶(LDH)及超氧化物歧化酶(SOD)活性，明显降低MDA含量，其机制与其抗氧自由基损伤有关。
5.目前存在问题展望
5.1存在问题 研究脑缺血损伤是一个复杂的级联反应，氧化应激的损伤作用(包括直接作用和间接作用)越来越受到学者的重视。已有研究表明氧自由基参与缺血性脑损伤病理过程。目前，人们对中医药防治脑缺血再灌注损伤的研究已取得一定成果，为临床防治脑缺血再灌注损伤及新药的开发提供了一定的理论依据。但已有的抗氧化中药的报道多为动物或体外实验。人体试验，特别是病理状态是否一致?是否还有同样的作用和疗效，均有待于进一步研究。此外，在脑缺血的中医药治疗上仍存在许多问题亟待解决：①缺乏符合中医证型的动物模型，从而无法体现中医药辨证施治的特色；②低水平重复试验较多，缺乏创新性，尚有待于大样本、多中心的研究；③缺乏针对脑缺血发病机理新进展的研究，尚不能全面揭示中药作用的确切途径。④动物试验的观察指标不足以完全反映药物的临床疗效。因此中医药治疗脑缺血的探索仍然任重而道远。
5.2研究方法 因自由基寿命短暂，并且缺乏足够敏感的技术直接检测生物体内的自由基，目前的研究仅集中在测定一些抗氧化酶SOD，GSH及MDA等测定上，自由基的检测大多是通过与其他分子如DNA、脂质体或蛋白质反应的产物或抗氧化剂的水平来间接反映的。标志物缺乏敏感性和特异性，还缺乏一套可行的方法来反映不同的氧化应激状态与疾病的相关性。因羟自由基性质活泼、寿命极短，其产生后即在该部位造成神经元损害并随之迅速代谢掉，故以往测定脑匀浆中羟自由基的方法具有一定的局限性，而脑内微透析造模和检测，可准确快速、连续监测清醒自由活动状态下脑内固定部位羟自由基的变化。
因此对氧化应激机制的研究，最好同时运用多种检测手段，利用的分子生物技术和现代医学手段，探讨缺血性脑血管病的氧化应激作用机制，建立一套评价体内氧化应激状态的评价体系，为临床治疗氧化损伤提供支持。
