关于壳聚糖的理化性及其作为免疫佐剂的研究进展

　　关键词：壳聚糖；理化性；免疫佐剂；疫苗 

　　论文摘要：免疫佐剂是一种免疫调节剂，可增强抗原的免疫原性、提高免疫效果。为增强疫苗的免疫原性在病毒性疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗的研制中常加入免疫佐剂。目前批准可用于人体的免疫佐剂是铝佐剂，因只能引起体液免疫，不能有效诱导细胞免疫，因此寻找新的免疫佐剂已成为疫苗研制迫切需要解决的问题。研究表明，壳聚糖具有免疫佐剂效应，具有良好的组织相容性，可生物降解，安全无毒，因此壳聚糖将成为一种很有应用价值的免疫佐剂。本文就壳聚糖的理化性及其免疫佐剂研究做一综述。 
　　　 
　　壳聚糖（Chitosan），也称几丁聚糖、脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性甲壳素，化学名为β（1，4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，由虾、蟹等富含甲壳素的物质经脱钙、脱蛋白、脱色、脱乙酰等工艺加工而成，是甲壳质脱乙酰反应后的物质，为分子量90～120kDa的生物大分子。从Braconot于1811年描述甲壳素迄今，甲壳素和壳聚糖的已有100多年。但由于壳聚糖具有提高免疫、活化细胞、预防癌症、抗衰老，调节机体等作用，因此在医药、保健、食品等多领域具广泛的用途。 
　　 
　　1壳聚糖的理化性 
　　 
　　甲壳素[1]广泛存在于甲壳纲动物虾和蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌（酵母、霉菌）的细胞壁和植物（如蘑菇）的细胞壁中。界每年生物合成的甲壳素将近100亿吨，是自然界中储量仅次于纤维素的第二大天然有机化合物。壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰基的产物，通常把脱去55%以上N-脱乙酸基，且能溶于1%乙酸或1%盐酸的甲壳素称之为壳聚糖。甲壳素与壳聚糖的差别，仅仅是N-脱乙酰度不同而已。壳聚糖是白色无定形、半透明、略有珍珠光泽的固体。因原料不同和制备方法不同，分子量有差异，不溶于水和碱溶液，可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸。在稀酸中，壳聚糖的主链会缓慢水解，溶液的黏度也会逐渐降低。壳聚糖氨基的氮原子上具有一对未公用的，能从溶液中结合一个氢质子，从而使壳聚糖成为带阳电荷的聚电解质，破坏壳聚糖分子内和分子间的氢键，使之溶于水中。壳聚糖的溶解度至少受3个因素的影响：①脱乙酰度。脱乙酰度越高，分子链上的游离氨基越多，离子化强度越高，也就越易溶于水；反之脱乙酰度越低，溶解度越小。②分子量。分子量越大，溶解度越小，因为壳聚糖分子内和分子间的氢键使得分子彼此缠绕在一起且比较僵硬。③酸的种类。稀硫酸,稀磷酸不能溶解壳聚糖。 
　　壳聚糖溶液的稳定性在使用过程中特别重要。壳聚糖的糖苷键是半缩醛结构，这种半缩醛结构对酸是不稳定的。壳聚糖的酸性溶液在放置过程中会发生酸催化的水解反应，壳聚糖分子的主链不断降解，黏度越来越低，分子量逐渐降低，最后被水解成寡糖和单糖。壳聚糖稀溶液的黏度不仅和溶液的PH有关系,也与壳聚糖的分子量有关系，壳聚糖分子量越高，其溶液的黏度就越大，分子量越低，黏度就越小。壳聚糖稀溶液的离子强度直接影响壳聚糖分子在溶液中的形态。壳聚糖能被人体吸收利用，与人体的组织器官及细胞有良好的组织相容性，无毒，具有生物降解性，几乎无免疫原性，同时具有多种生物活性。经过化学改性得到的壳聚糖衍生物, 其物理化学性质得到改善, 使其应用范围大大拓展, 因此壳聚糖及其衍生物的开发及应用研究已引起人们广泛的兴趣。 
　　 
　　2壳聚糖作为DNA疫苗的免疫佐剂研究 
　　 
　　有效的疫苗都需要一个合适的抗原传递系统，即存在佐剂依赖性或载体依赖性。许多研究表明壳聚糖可有效的促进局部，特别是粘膜局部的免疫反应，增强抗原传递系统功能，具有免疫佐剂的效应。DNA疫苗是利用重组DNA技术将保护性抗原蛋白基因克隆到真核表达载体，然后将重组的质粒DNA直接导宿主体内，使抗原蛋白经过内源性表达递呈给免疫系统，诱发机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应，从而达到预防和疾病的目的。尽管DNA疫苗已经用于治疗一些动物疾病，但DNA疫苗在人体的免疫原性弱，不能有效诱导免疫应答限制了它的应用。将基因疫苗涂抹在皮肤表面进行免疫，由于免疫原性弱，影响皮肤对质粒的吸收及免疫效果，同时由于质粒本身容易降解，不能产生足够高的抗体水平来保护宿主不受疾病的感染。壳聚糖及其衍生物能与DNA形成聚电解质聚合物，对质粒DNA进行保护，可减少质粒DNA的降解，增强免疫细胞的识别，延长疫苗的作用时间，从而加强免疫效果。王焱冰[2]等以壳聚糖包裹不同的草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)基因DNA疫苗pcDNA3-Lzp3(pLzp3)和pLC，通过皮肤擦拭免疫小鼠，以ELISA方法检测抗体水平，对卵巢做病理切片检测。ELISA结果显示用壳聚糖包裹的pLC组在皮肤免疫中显示出优势，卵巢病理切片结果正常，说明壳聚糖包裹质粒皮肤免疫小鼠较纯质粒免疫效果更为显著。壳聚糖-DNA提高了皮肤免疫效果，有望成为一种有效的介导DNA疫苗进行皮肤免疫的载体物质。口服和鼻腔接种疫苗能够诱导黏膜免疫，这种局部免疫对于抵御经黏膜感染的病原微生物是极其重要的。然而，口服疫苗在消化道内易被降解，抗原的吸收效率低 。经鼻腔接种的疫苗虽不像在肠道内那样降解明显，但在鼻腔内半清除时间仅15 min，抗原很难逾越上皮屏障。将疫苗和递呈系统混合制备成微粒，就可以有效地防止疫苗在到达黏膜组织前被降解，因此许多学者将壳聚糖用于黏膜递呈和免疫佐剂作用研究。 
　　胡云章[3]等选取乙肝病毒表面抗原的亚单位疫苗及DNA疫苗作为模型，以壳聚糖作为载体，通过沉淀/凝聚法制备壳聚糖微球疫苗，构建了鼻腔免疫释放系统，对其免疫效果进行分析，并与腹腔及肌肉注射免疫方法进行比较。结果表明，在HBV亚单位疫苗诱导的免疫应答中，微球疫苗体现出一定程度的缓释作用，腹腔免疫及鼻腔免疫在产生抗体应答方面的差异无显著意义，由此提示鼻腔免疫可以作为亚单位微球疫苗接种的新型途径，但其有效性还待进一步确定。在HBV DNA微球疫苗所诱导的免疫应答中，传统形式肌肉注射所诱导的IgG应答在12周时升至最高，随后出现下降趋势；而微球形式的肌肉注射和鼻腔免疫所诱导的IgG应答，则在16周时才达最高，且峰值远远高于传统形式肌肉注射组。说明壳聚糖微球对于DNA疫苗具有保护作用及缓释作用，能够使诱导的IgG应答水平阈值的时间延长，并且鼻粘膜可能比肌肉组织更有利于吸收和提呈DNA疫苗。此实验表明微球疫苗鼻腔免疫能够有效诱导机体的免疫应答，产生很好的免疫保护力和免疫记忆，为发展一种疫苗新型免疫形式及途径提供了理论依据。 
　　Jiang等对壳聚糖-乙肝核心抗原微粒能否诱导更强的免疫应答及其潜在机制进行了探讨。结果显示和裸DNA相比吞噬细胞对壳聚糖微粒有较高的摄取率；壳聚糖微粒注射部位未见明显组织学改变。高抗体效价、高水平IFN-γ的分泌说明壳聚糖微粒显著提高了免疫原性。Khatri 等对乙肝病毒壳聚糖微粒鼻粘膜免疫进行了研究。复凝聚法制备具有特定大小、形态、表面电荷、荷载率和抗核酸酶消化能力及高转染效率的乙肝病毒壳聚糖微粒。结果显示鼻粘膜免疫后乙肝病毒壳聚糖微粒诱导的血清抗HBsAg抗体滴度比裸DNA疫苗和铝佐剂疫苗均要低，而且既能诱导粘膜分泌sIgA，也能产生体液免疫和细胞免疫。此研究表明壳聚糖微粒作为DNA疫苗的载体和佐剂，通过鼻粘膜免疫途径，能诱导有效的免疫反应。 　　3壳聚糖作为微生物疫苗的免疫佐剂研究 

　　Kang等采用三聚磷酸盐与壳聚糖发生离子交联的方法，制备得到包裹支气管败血性博德特氏菌皮肤坏死毒素(BBD)的壳聚糖载药微球。然后将载有BBD的壳聚糖微球直接通过鼻腔给大鼠进行免疫后，采用ELISA法来检测血清、鼻流出液及唾液中BBD特异的免疫反应。结果显示，鼻腔中BBD特异的IgA抗体滴度和血清中的IgG及IgA滴度均与给药时间和给药剂量有关。说明鼻内免疫对鼻相关的淋巴样组织有靶向作用，同时也说明壳聚糖对于鼻黏膜免疫具有免疫佐剂作用。常海燕[4]等将壳聚糖和流感病毒灭活疫苗混合后经腹腔免疫BALB/c小鼠，免疫后检测血清中IgG抗体及鼻洗液中IgA抗体水平，加强免疫后1周，用致死性(40LD50)流感病毒A/PR/8/34(H1N1)攻击小鼠，发现壳聚糖作佐剂能显著增强血清抗体含量，并提高小鼠抗病毒攻击的能力。Read等则将壳聚糖和三价流感灭活疫苗一起鼻腔及肌肉免疫小鼠,发现壳聚糖可以明显提高其局部和血清抗体反应。研究结果显示壳聚糖作为流感病毒灭活疫苗的新型佐剂，可以增强疫苗的抗体反应。 
　　谢勇[5]等对以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗的免疫保护作用及其机制进行了深入的研究。他们将BALB/c小鼠随机分为空白对照组（PBS溶液）、壳聚糖酸溶液组、壳聚糖颗粒组、Hp抗原组、Hp抗原+壳聚糖酸溶液组、Hp抗原+壳聚糖颗粒组、Hp抗原+霍乱毒素（CT）组、Hp抗原+壳聚糖酸溶液+CT组及Hp抗原+壳聚糖颗粒+CT组，各组于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次。结果显示以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率达60％,与以CT为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率(58.33％)相似，同时以CT+壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的保护率为84.62％、85.71％。含佐剂的Hp疫苗所诱导产生的Hp IgG水平显著高于对照组及无佐剂组，而以CT+壳聚糖为佐剂组所产生的抗Hp IgG水平显著高于仅以CT或壳聚糖为佐剂组。胃黏膜内sIgA及特异性抗Hp IgA水平在壳聚糖为佐剂组与以CT为佐剂组无差别，显著高于无佐剂组，而壳聚糖与CT联合应用组显著高于单以CT为佐剂组。研究结果表明以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗对Hp感染具有免疫保护作用，并可成功诱导黏膜局部的特异性体液免疫应答，这可能在其免疫防御中起作用；而且可促进Thl和Th2的混合免疫反应，逆转Hp感染所致Th2反应的抑制、使Thl和Th2反应达到平衡，从而发挥其免疫保护作用。 
　　Ahire 等对壳聚糖包裹的破伤风毒素（tetanus toxoid，TT）疫苗诱导的全身和局部免疫应答进行了研究。小鼠随机分为壳聚糖+TT抗原组（Chitosan encapsulated tetanus toxoid ，CS-TT）、TT抗原组、壳聚糖组，三组均经口服途径免疫小鼠。ELISA法检测血清中抗破伤风毒素IgG，检测洗肠液及粪便中抗破伤风毒素IgA。观察到CS-TT组小鼠的免疫反应有剂量依赖性，全身和局部免疫有很大程度的提高，表明壳聚糖微粒悬液包裹了高分子量的破伤风毒素，诱导了肠的IgA分泌和体循环的IgG的产生。David等将壳聚糖抗原蛋白溶液皮下免疫小鼠，结果显示小鼠特异性抗体滴度增加5倍，脾CD4+ T细胞增值增加6倍。强的抗体滴度增长和迟发型超敏反应（DTH）揭示壳聚糖诱导了体液免疫和细胞免疫。可能的机制为：粘稠的壳聚糖溶液增加了抗原的滞留时间，免疫7天后，大于60%的抗原蛋白仍保留在注射部位；壳聚糖诱导了67%引流淋巴结细胞的瞬时膨胀，膨胀的高峰期持续在壳聚糖免疫后14-21天，之后以多糖的方式降解。 

　　结语

　　综上所述，壳聚糖作为免疫佐剂，通过皮肤、口服、鼻腔、皮下等不同的免疫途径，在多种疫苗研究中发挥重要作用，可有效的诱导局部黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应。壳聚糖及其衍生物良好的生物黏附性，促进吸收作用及免疫调节作用使其在疫苗黏膜给药系统中的应用有着其他载体材料不可比拟的优势。以壳聚糖为佐剂的生物黏附给药系统可显著提高药物在各黏膜表面的滞留时间，从而提高生物利用度。随着研究的不断深入，壳聚糖作为免疫佐剂必将发挥更重要的作用。 
　　 
　　 
　　[1] 蒋挺大.壳聚糖〔第二版)[M].北京:化学出版社，2006.1-35. 
　　[2] 王焱冰，李轶杰，潘鑫艳，等.壳聚糖介导增强DNA疫苗皮肤免疫效果的研究[J]. 生物技术，2006，16（2）：68-71. 
　　[3] 胡云章，李菁，刘国栋，等. HBV壳聚糖微球疫苗鼻腔免疫的初步研究[J]. 
　　生物制品学杂志，2005，18（2）：143-145. 
　　[4] 常海燕，陈建军，方芳，等.流感病毒灭活疫苗新型佐剂-壳聚糖增强免疫 
　　作用研究[J].中国生物制品学杂志，2004，17（6）：383-384. 
　　[5]谢勇，龚燕锋，周南进，等. 以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗诱导的体液免疫应答及其免疫保护效应[J].中国病理生理杂志，2007，23(3)：438-443.