老龄肾阳虚证的差异表达基因谱分析
作者：李炜弘 雍小嘉 范怀昌 谭从娥 张天娥 王米渠
【摘要】 目的采用基因表达谱芯片技术，分析老龄肾阳虚证的发生与基因表达异常间的联系。方法筛选肾阳虚证患者3名和正常对照者3名，采用美国Affymetrix公司的HG-u133Plus 2.0基因表达谱芯片，通过组间比较，筛选出老龄肾阳虚患者差异表达基因。结果芯片数据组间比较分析后获得34条差异表达基因，聚类分析得到6条有特征性地差异表达基因，主要涉及细胞周期和凋亡，肿瘤发生以及免疫。结论老龄肾阳虚证的发生涉及一系列免疫紊乱的复杂的过程，可能与个体的衰老存在密切关联。
【关键词】 肾阳虚证 差异表达基因 免疫 衰老
Abstract：ObjectiveTo explore the relevance between aged kidney-Yang deficiency syndrome and the differentially expressed genes by cDNA arrary.MethodsThree kidney-Yang deficiency patients and three healthy people were selected as samples during the epidemiologic survey of the kidney-Yang deficiency syndrome. The differentially expressed genes were screened by applying HG-u133Plus2.0 of Affymetrix GeneChip.Results34 common differentially expressed genes were obtained after comparison between patients and healthy peoples. 6 differentially expressed genes which are related to cell cycle, apoptosis, tumorigenesis and immunity were obtained by cluster analysis.ConclusionThe aged kidney-Yang deficiency syndrome is related to the dysfunction of the immune system, may be closed related to body ageing as well.
Key words：kidney-Yang deficiency; Differentially expressed gene; Immune response; Ageing
随着人类基因组计划的深入，尤其是功能基因组学研究技术的不断，在基因表达谱芯片技术平台上［1］开展的“证候-基因表达谱”研究从一个新的视角，系统、全面地深化人们对中医证候的认识，把证候与分子的功能联系起来。在以往对肾阳虚的研究中，已进行肾阳虚半定量化操作标准［2］以及虚寒证、心阳虚证等基因芯片实验研究［3］提示，肾阳虚证一定具有特定的分子生物学基础；肾阳虚的辨证论治其理其法在基因水平、分子水平有深层次的依据。研究中还发现年龄是“证”的基因表达不可忽略的影响因素，而肾阳虚证在老龄人群中占有较大比例。结合多年“证候－基因组”研究的经验，笔者选用国际公认的美国Affymetrix公司的人全基因组表达谱芯片，开展了特定老龄人群肾阳虚证的差异基因表达谱的分析研究，探讨老龄肾阳虚证所涉及的分子生物学过程，为进一步揭示肾阳虚证的本质奠定基础。
1 研究对象
在60岁以上老龄人群肾阳虚证的流行病学调查过程中筛选了3例肾阳虚证患者，年龄在60～70岁之间，体检无西医诊断的器质性疾病，经中医专家诊断和肾阳虚证量表［2］评分相结合，符合典型肾阳虚证诊断。另外，选取同年龄段、性别一致的3例健康老人为正常对照，此3例对照者经体检，均无西医诊断的器质性疾病，无身体不适症状，并经过中医专家诊断和肾阳虚证量表评分，均无肾阳虚临床表征。
2 方法
2.1 提取总RNA分别采取肾阳虚证患者与正常人的空腹静脉血10 ml，裂解红细胞，分离获得白细胞，采用Trizol法提取总RNA，并对总RNA进行定量、质检。
2.2 基因芯片检测利用单轮cRNA扩增、生物素标记法对样品进行靶标制备，然后用于芯片杂交；芯片采用美国Affymetrix公司的HG-u133Plus 2.0基因表达谱芯片，每例样品检测1张，共6张。用Fluidics Station 450进行洗脱和染色，然后用Scanner 3000扫描芯片；用GeneChip Operating software (GCOS 1.4)分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，然后dChip软件做校正和归一化处理，最后以差异为1.5倍的标准来确定差异表达基因。
3 结果
3.1 肾阳虚证病例筛选结果限定年龄在60～70岁，根据前期研究制定的肾阳虚证量表评分系统［2］，结合成都中医药大学中医诊断学专家诊断结果，3例患者皆属于典型的老年肾阳虚证患者，2女1男，平均年龄65.78岁；3例健康老年人，2女1男，平均年龄63.8岁。其症状因子及各因子定量评分见表1。
3例患者均以腰膝酸软、畏寒、肢冷、腰背发冷为主要症状，兼证有神疲倦怠、头晕、性欲减退、夜尿频多、尺脉不足等。3例患者皆属于典型的肾阳虚证患者，与3例健康对照有明显差异。
3.2 基因芯片实验结果
3.2.1 肾阳虚证差异表达基因Affymetrix公司寡核苷酸芯片检测结果已得到国际权威学术界的公认。采用成组T检验的方法分析结果，用fold change 大于1.5或者小于0.6667，p value小于0.05，得到肾阳虚证组与健康对照组间的差异表达基因34个，其中表达水平下调的有28条基因，表达水平上调的仅有6条基因。见表2。
3.2.2 肾阳虚证差异表达基因的聚类分析采用Cluster3.0对上述34条基因进行聚类分析，如图1所示。肾阳虚证组和健康对照组间有6条基因有明显的组间辨识特征。见表3。
表1 6例样本肾阳虚证各症状因子及其定量评分结果（略）
sh1，sh2，sh3为3例典型肾阳虚证患者，肾阳虚证半定量诊断总分值分别为36，29，36; h1，h2，h3为3例健康对照者，肾阳虚证半定量诊断总分值分别为3，2，5
表2 肾阳虚证差异表达基因（略）
表3 肾阳虚证特征差异表达基因（略）
图1 肾阳虚证差异表达基因聚类图（略）
4 讨论
4.1 实验的质量控制既往对肾阳虚证病机、诊断、、生理、生化、神经-内分泌-免疫调控等研究，提示该证很可能涉及一大群差异表达基因，拥有复杂而独特的分子生物学内涵［4］。基因芯片以大规模、高通量的方式可同时研究多个基因及多个基因组在各种生理病理状态下的表达，以了解基因及基因组之间的相互作用和调控，有利于研究肾阳虚证发生的分子生物学基础。但基因芯片的结论受到样本量大小、样本同质性、芯片检测系统稳定性、芯片结果分析软件的适用性等多因素的影响，在所获结论上有较大的偏倚。限于经费有限，无法开展大样本的研究，故我们在实验设计上做了多方考虑。首先采用量表测评和专家诊断两种方法确定肾阳虚证患者，年龄控制在10年的区间，排除西医器质性疾病，尽可能保证样本的同质性；其次采用美国Affymetrix公司的HG-u133Plus2.0基因表达谱芯片，芯片检测系统［5］的可靠性和稳定性在世界上都是较为公认的；最后采用T检验组间比较筛选出肾阳虚证差异表达基因，较过去单张芯片间两两比较结论更为可信。
4.2 发育与肿瘤相关基因的集中表达提示老龄肾阳虚证和衰老的关系 从表2可见，本研究筛选出的34条差异表达基因中，有7条基因（PTP4A1，PGM1，MAP2K4，TGM3，BMX，FHIT，CDKN1C）都是与肿瘤的发生、抑制或转移相关的，有7条基因（DEGS1，ABCG1，BACH2，MAP1LC3A，IRAK2，CLEC4D）与巨噬细胞吞噬等免疫相关，有3条基因（ZNF354A，MAP2K6，TP53I13）是和细胞的周期，发育等相关，有7条基因（CTA-126B4.3，PCNX等）的功能尚无研究报道。从图1和表3可见在肾阳虚证组和健康对照组之间有6条基因（CTA-126B4.3，HBD，CDKN1C，TP53I13，MBNL1，KIAA0241）具有特别显著的组间一致性，并且病人组相对于健康组，均呈表达水平上调，而34条基因中的其余28条基因表达水平均呈下调趋势。限于篇幅，仅对此6条基因的功能分析如下：
如CDKN1C 编码对细胞周期合成有抑制的蛋白，产生对细胞增殖的负性调控。该基因［6］的突变以及甲基化和贝威二氏综合征、肾上腺肿瘤等发生有关，已被列为肿瘤抑制的候选基因，其表达水平的变化也可能影响细胞周期及其增殖等。本实验中该基因表达水平上调可能与去甲基化有关，并可能成为老龄人群肿瘤发生率增加的因素之一，而年龄在去甲基化过程中是否担任一定角色还有待进一步研究。TP53I13在细胞周期调控、DNA修复和细胞凋亡中都发挥着关键作用［7］，其突变和表达水平的改变都可能抑制肿瘤的发生，属于肿瘤抑制基因类。KIAA0241是和肿瘤［8］发生相关的转录因子，分子通路分析认为该基因是早期乳腺癌转移的信号之一。这3条基因都与肿瘤发生、转移、抑制相关，而患者学样提取时尚无任何肿瘤的临床体征，随访1年仍未有肿瘤体征，可能用衰老机制更能解释这些基因的表达水平的变化。HBD不仅与血红蛋白合成有关，而且广泛存在于人的分泌腺和上皮细胞中［9］，如乳腺、气管、肾、小肠以及血浆等，在不同组织器官中有不同的表达量，主要参与免疫防御［10］，HBD基因表达水平上调往往和炎症有密切关系，实验中显示人白细胞中的该基因表达水平上调可能提示所选病例中存在炎症，但我们已从医学角度排除了器质性病变（包括可诊断的感染），临床诊断和基因表达的背离可能存在多个原因，但笔者认为可以提示老龄肾阳虚证的发生可能存在潜在的、隐性的炎症。MBNL1基因所编码的蛋白［11］能导致肌肉僵硬，失去弹性，在肌肉发育中也扮演重要角色，包括横膈膜和舌体，其突变［12］能引起僵直性肌营养不良。本实验中该基因表达水平上调可以解释老龄肾阳虚证患者肌肉失去弹性这一衰老现象。6条基因中仅有CTA-126B4.3基因尚无功能研究报道，可以成为中医证候研究基因功能的方向。
综上所述，老龄肾阳虚证的差异基因表达谱提示，老龄肾阳虚证的发生涉及一系列与细胞周期、凋亡、肿瘤发生与抑制相关的复杂的免疫紊乱过程，而这一过程不能用临床的炎症、感染、肿瘤来解释，推测其可能与个体的衰老存在密切关联。中医认为“阳主阴从”，阳气为生之本，而肾阳又为机体阳气之根本，肾阳虚衰，导致对全身脏腑的温煦、推动功能减退，而表现出腰膝酸软、畏寒、肢冷、腰背发冷、性欲减退为代表的一系列症状和体征。肾阳虚证的差异基因表达谱是仅出现在老龄肾阳虚证，还是见于各个年龄层的肾阳虚证患者，以及这一分子生物学现象对机体疾病、寿命、生存质量等的影响可能解释肾阳虚与衰老的关联，值得我们继续深入探讨。
【】
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