当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后CDK2蛋白的表达
作者：冯金彩 喻小红 李培安
【摘要】 目的：观察当归对缺血再灌注损伤心肌细胞内CDK2蛋白表达的影响，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将35只SD大鼠随机分成4组：正常对照组(n=5)、假手术组(n=10)、缺血再灌注组(n=10)、当归组(n=10) ,建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内CDK2蛋白表达的变化。利用HPIAS-2000图像分析系统测定CDK2蛋白在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内CDK2蛋白表达弱；当归治疗组心肌细胞内CDK2蛋白表达弱。假手术组心肌细胞内CDK2蛋白表达强，缺血再灌注损伤组CDK2蛋白表达强。图像分析结果显示，正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间CDK2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞的增殖起着重要的作用。
【关键词】 当归注射液 缺血再灌注 心肌 CDK2蛋白
心肌缺血再灌注损伤( ischemia reperfusion injury, IRI )在急性心肌梗死再灌注治疗的病理生理过程中起着重要的作用。近年来研究发现心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡有着密切的关系。赵明中等［1］研究发现心肌缺血再灌注可减少心肌缺血细胞凋亡,同时也能加速受损心肌细胞的凋亡过程，且凋亡细胞主要位于心肌纤维收缩带区域内和心肌梗死区周围。心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡随再灌注时间的延长而显著增多。近年来凋亡机制参与心肌缺血再灌注损伤成为临床研究的热点。
目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种能绝对减少心肌梗死,对抗心肌缺血。当归为伞形科植物当归Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性温，能补血和血,调经止痛,润燥滑肠。有报道［2］, 当归对冠心病患者应用当归注射液治疗能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明显改善胸痛、胸闷等临床症状和心电图缺血性ST-T 的变化, 是治疗冠心病的有效药物［3］。
CDK2是酪氨酸蛋白激酶家族的成员之一，其基因定位于染色体12q13，编码33ku的蛋白质，为苏氨酸激酶，是细胞周期素依赖性激酶复合体的一个亚基，在G1/S期的转换中起关键作用。而G1/ S 的调控点又是细胞内外信号经过传递、整合汇集到细胞核,对细胞的增殖进行调控的关键点［4］。本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/ 再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/ 再灌注损伤的作用机理，旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备及分组
选用健康雄性Wistar大鼠（SPF级）35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg·(100 g)-1 ,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［呼吸频率60 次·min-1 ,潮气量2ml·(100g)-1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组: 正常对照组（不做任何处理）；假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）；缺血再灌注损伤组(IR)（ 缺血/ 再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml / kg，结扎左冠状动脉前降支45min ,再灌注120 min ）；当归注射液预处理组（在结扎前20min静脉注射当归注射液0.8ml/ kg , 其它处理同缺血/ 再灌注组）。
1.2 主要试剂
25%当归注射液(武汉大学中南制药厂)；即用型兔抗鼠CDK2单克隆抗体；即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒；DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 常规HE染色。
1.3.2 免疫组织化学S-P法检测CDK2相关抗原 主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，CDK2采用高压抗原修复，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗4 ℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为CDK2的阳性对照组。
1.4 免疫组织化学结果判断
CDK2以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对CDK2抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.5 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
CDK2蛋白的表达：正常对照组：心肌细胞内可见少量的棕黄色颗粒，CDK2蛋白表达弱；假手术组：心肌细胞内也可见少量的棕黄色颗粒，CDK2蛋白表达弱；缺血再灌注损伤组：心肌细胞内可见密集分布的棕黄色颗粒，CDK2蛋白表达强；当归治疗组：心肌细胞内可见少量的棕黄色颗粒，CDK2蛋白表达弱。图像分析结果显示：正常对照组的平均光密度为0.1561±0.0072; 假手术组的平均光密度为0.1538±0.0064; 缺血再灌注损伤组的平均光密度为2.4213±0.1837; 当归治疗组的平均光密度为0.1486±0.0368。正常对照组的阳性面积率为0.0836±0.0458; 假手术组的阳性面积率为0.0756±0.0193; 缺血再灌注损伤组的阳性面积率为2.2475±0.0095;当归治疗组的阳性面积率为0.0764±0.0327。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05)。经q 检验，正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间CDK2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间CDK2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。
表1 当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后各组CDK2蛋白表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注：* 正常对照组、假手术组、当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较， P＜0.01；# 当归治疗组、假手术组与正常对照组比较， P＞0.05。
3 讨论
细胞凋亡(apop tosis)是细胞死亡形式之一,是有核细胞在一定条件下启动其自身内部机制,通过内源性DNA内切酶的激活而发生死亡的过程。越来越多研究表明,心肌缺血/再灌注( I/R)损伤与细胞凋亡密切相关。当归含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等。目前已证明,当归对心血管系统、血液造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的药理作用。在心血管疾病中,经常发生缺血再灌注损伤,其机制可能是多因素的,但主要有三个环节:即能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成,其中氧自由基是造成缺血再灌注损伤的直接原因［6］。缺血再灌注过程中,机体可通过多种途经产生氧自由基,氧自由基与生物膜发生一系列反应,可破坏心肌细胞结构、损伤心肌细胞膜, 产生大量的脂质过氧化物。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注损伤慨念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚,但巳经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡。已经证实,人类心肌梗死除细胞坏死外,细胞凋亡也参与了梗死的病理过程,细胞凋亡不仅影响梗死面积,而且促成心脏结构的重构,心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡现象［7～9］。缺血再灌注损伤对心肌组织的结构和功能的影响一直是研究的重点之一。
细胞周期的精密调控是细胞正常生长的关键性因素，而一系列的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是细胞周期调控的核心装置［10］。CDKs的活性受到多种机制的调节，包括与调节亚单位cyclins结合，磷酸化与去磷酸化以及与CDK抑制因子CKIs结合。CDK2是酪氨酸蛋白激酶家族的成员之一，其基因定位于染色体12q13，编码33ku的蛋白质，为苏氨酸激酶，是细胞周期素依赖性激酶复合体的一个亚基，在G1/S期的转换中起关键作用，而G1/ S 的调控点又是细胞内外信号经过传递、整合汇集到细胞核,对细胞的增殖进行调控的关键点［11］。该点调控的异常与肿瘤的发生关系密切。在G1 期中, cyclinE 和CDK2 结合形成cyclinE-CDK2复合物，它不仅作用于G1/ S 期,还对于DNA 复制的启动非常重要。在G1 期中，cyclin 和CDK结合，导致CDK活化使视网膜母细胞瘤易感基因( retinobla-stoma, Rb) 的蛋白产物磷酸化,失去对转录因子E2F-1 的抑制, E2F-1 作用于二氢叶酸还原酶靶基因,加速细胞从G1期进入S 期［12］。因此CDK2活性增高，可以促进细胞的增殖、分化，是细胞周期的正调节因子。Aikawa T等在非肾系细胞的研究中发现，细胞增生时CDK2的表达明显增高，而细胞处于静止时CDK2水平则较低［13］。HuyHaodao等人在研究不同剂量内皮素对体内小血管的作用的过程中也发现，低剂量的内皮素只能使内皮细胞肥大，CDK2的水平处于一般状态，而高剂量的内皮素能促进内皮细胞的增殖，同时可以检测到CDK2激酶活性增强，CDK2表达水平也相应升高［14］。另有学者在对结肠癌，食管鳞状细胞癌及非小细胞肺癌的研究中发现都有CDK2表达及其活性的增高，其异常激活参与肿瘤的恶性进展。Volm等用免疫组化的方法研究显示在40例儿童组急性白血病患者中CDK2表达增高。这些研究均提示CDK2与细胞的异常增殖有关，其异常表达能促使细胞增殖加速。
本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/ 再灌注过程心肌组织中CDK2蛋白的表达,实验结果表明，正常对照组、当归组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间CDK2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。因此我们推测CDK2在当归注射液对缺血/ 再灌注过程心肌组织中发挥了细胞周期正性调节因子的作用。
缺血再灌注损伤本身是个多因素协同的过程,缺血再灌注组织发生细胞凋亡的机制也是一个多因素的过程,心肌细胞坏死与细胞凋亡有着一些共同的始动因素,如氧自由基、钙离子超载、细胞因子的释放、中性粒细胞侵润等既可以引起细胞凋亡,也可以引起细胞坏死。无疑通过各个环节对抗细胞凋亡必然也会对抗细胞的坏死起一定的作用。现在对心肌缺血再灌注引起细胞凋亡的确切机制尚未阐明,对抗心肌细胞凋亡的治疗也大多处于动物试验阶段。特别是基因治疗离临床应用还有一段距离。
从以上的实验结果和讨论来分析当归注射液为防治缺血再灌注损伤的应用具有重要的研究意义，并且为加强心肌保护作用提供重要的理论依据。并进一步证实缺血后处理对再灌注心肌细胞具有抗凋亡作用, 提示缺血后处理的心肌保护。
【】
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