超声波提取防风色原酮的研究

                作者：韩忠明，杨荣艳，王云贺，韩梅，孔伟伟，杨利民 

【摘要】  目的优选防风色原酮的超声波提取工艺。方法以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量为指标 ,采用正交实验法优选超声波提取防风色原酮的最佳工艺。结果最佳提取条件为料液比为1∶30 ,超声时间45 min ,超声温度50 ℃ ,超声频率90 kHz。结论采用超声波提取技术提取防风色原酮，提取时间短，提取效率高，可用于防风色原酮的提取。

【关键词】  超声波; 防风; 色原酮; 正交实验; 高效液相色谱

　　Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction conditions of chromone from Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk. by ultrasonic wave. MethodsThe contents of prim?O?glucosylcimifugin, cimifugin, 5?O?methylvisammioside and sec?O?glucosylhamaudol were served as indicating indexes, and the extraction conditions were optimized by orthogonal test. ResultsThe optimal ultrasonic condition was as follows: the feed-liquid rate was 1∶30; the extractive time was 45 min; the extractive temperature was 50℃ and the supersonic frequency was 90 kHz. ConclusionThe extraction of chromone from S.divaricata with ultrasonic wave is found to be a rapid and efficient extraction method with short time and high production yield.

　　Key words： Ultrasonic wave;   Saposhnikovia divaricata;   Chromone;   Orthogonal test;   HPLC
   
　　防风 Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.为伞形科防风属多年生草本植物 ,以未抽薹的干燥根入药，是我国常用大宗中药材之一，具有解表祛风、胜湿、止痉功能，用于感冒头疼、风湿痹痛、风疹瘙痒、破伤风等［1］。药理研究化其主要的活性成分为升麻素苷、升麻素、5?O?甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷等色原酮类以及多糖、挥发油等 ,具有解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集等多种功效［2～4］。超声波法提取中药有效成分是近年来起来的一种新方法 ,具有设备简单、操作方便提取时间短、效率高和节能等优点［5］。有关超声波提取防风中色原酮的研究已有报道［6］ ,但仅仅以升麻素苷和5?O?甲基维斯阿米醇苷两种色原酮为指标 ,而现在评价防风药材则以升麻素苷、升麻素、5?O?甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷4种色原酮为主要药效物质和质量控制评价指标［7］。本文以升麻素苷、升麻素、5?O?甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷4种色原酮的质量分数为指标 ,对超声波提取防风中4种色原酮的工艺参数进行了研究 ,为防风综合开发利用提供有效的提取方法和依据。

　　1  仪器与材料
   
　　DL-1000E超声波清洗器(上海之信仪器有限公司); Agilent 1100高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、DAD检测器、手动进样器和Agilent化学工作站) ; AUY 220天平(日本岛津)。提取用甲醇为分析纯(北京化工厂)和HPLC用甲醇为色谱纯甲醇(Fisher 公司)。
   
　　实验材料系2007?09末采于白城GAP基地3年生未抽薹防风的根 ,经吉林农业大学张连学教授鉴定为伞形科柴胡属防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.。对照品由药品生物制品检定所提供 ,升麻素苷、升麻素、5?O?甲基维斯阿米醇苷 、亥茅酚苷 批号分别为111522，111710，111523，111714。

　　2  方法与结果

　　2.1  防风4种色原酮的HPLC测定

　　2.1.1  色谱分析条件Diamonsil C18 (4.6 mm×200 mm ,5 μm) 色谱柱 ;柱温30℃ ;波长254 nm ;甲醇-水梯度洗脱 ：甲醇：0～15 min :20%～45% ，15～25 min :45%～70% ;流速1 ml·min-1。

　　2.1.2  供试品溶液的制备防风根经45 ℃烘干 ,粉碎过30目筛。精密称取0.3 g样品 ,浸泡2 h ,按照不同因素-水平进行超声提取 ,过滤 ,定容于100 ml容量瓶中 ,过0.45 μm滤膜 ,精密吸取20 μl进样 ,按外标法测定。

　　2.1.3  混合对照品溶液的配制 精密称取经五氧化二磷干燥后的升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷适量 ,配成浓度为 :升麻素苷: 0.3 mg·ml-1，升麻素: 0.04 mg·ml-1，5-O-甲基维斯阿米醇苷: 0.5 mg·ml-1和亥茅酚苷0.02 mg·ml-1的混合对照品溶液。分别精密量取0.25，1，2，3，4，5 ml ,定容于10 ml容量瓶中。

　　2.1.4  标准曲线的制备 分别吸取上述对照品溶液20 μl按色谱条件进样 ,测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标(Y) ,进样量为横坐标(X) ,绘制标准曲线 ,回归方程。
   
　　升麻素苷 :Y = 3 288. 853 74 X + 68.774 277(r= 0.999 85) ,线性范围 :0.15～3 μg ;
   
　　升麻素 :Y = 2 578.415 45 X + 7.520 469(r = 0.999 72) ,线性范围0.02～0.4 μg ;
   
　　5-O-甲基维斯阿米醇苷 :Y = 2 010 X + 68.751 405(r = 0.999 59) ,线性范围0.25～5 μg ;
   
　　亥茅酚苷 :Y = 4 125.812 67 X + 5.313 809(r= 0.999 71) ,线性范围0.01～0.2 μg。   

　　混合对照品和供试品的色谱图见图1。

　　图1  混合对照品 (a) 和供试品 (b) 的HPLC图（略）

　　2.1.5  稳定性实验精密吸取混合对照品溶液20 μl ,按色谱条件每隔4 h 进样1 次 ,共测定7次。计算4种色原酮峰面积。结果升麻素苷、升麻素、5?O?甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的RSD值分别为0.98%，1.63%，1.53%和0.99%。表明24 h内4个对照品稳定性良好。

　　2.1.6  精密度实验精密吸取混合对照品溶液20 μl ,按上述色谱条件进行分析 ,连续5次。计算4种色原酮峰面积积分的RSD值分别为0.91%，1.54%，1.76%和1.95%。

　　2.1.7  重复性实验精密称取防风样品5份，按上述操作方法制备供试品溶液 ,分别精密吸取供试品溶液20 μl ,按照上述色谱条件测定峰面积 ,结果4种色原酮峰面积积分的RSD分别为1.74%，2.68%，2.30%和2.16%。

　　2.1.8  回收率实验取已知含量的供试品5 份 ,分别加入定量的升麻素苷、升麻素、5?O?甲基维斯阿米醇苷及亥茅酚苷对照品 ,按上述色谱条件测定。计算4种色原酮的回收率 ,结果升麻素苷平均回收率为104.72% ,RSD为1.57%(n= 5) ;升麻素平均回收率为104.98% ,RSD为1.64%(n= 5) ;5-O-甲基维斯阿米醇苷平均回收率为104.93% ,RSD为1.41%(n= 5) ;亥茅酚苷平均回收率为104.47% ,RSD为1.53%(n= 5)。

　　2.2  单因素分析

　　2.2.1  料液比对总色原酮提取率的影响精密称定0.3 g防风样品 ,分别准确加入甲醇 3 ml(料液比1∶10)、6 ml(料液比1∶20)、9 ml(料液比1∶30)、12 ml(料液比1∶40)和15 ml(料液比1∶50)在相同的条件下考察料液比对提取率的影响 ,结果总色原酮质量分数依次为0.932 1% ，0.953 8%，0.962 3%，0.965 6%，0.966 6% 。可见在一定范围内 , 随着料液质量体积比的增加，提取率增幅增大，在料液比为1∶30处达到最大。当料液比继续增加时，总色原酮提取量的增加幅度较小。鉴于节约溶剂的原则 ,故将料液比定为1∶30左右。

　　2.2.2  超声时间对提取率的影响在料液比1∶30 ,其它条件相同下选择时间15，30，45，60 ，75 min进行超声萃取 ,结果总色原酮质量分数依次为0.932 5%，0.966 9%，0.986 3% ，0.989%，0.990 6%。可以看出，随着超声波提取时间的加长，总色原酮提取率的增幅不断减少，这可能由于提取率正在接近最高值，并且由于在提取过程中杂质的不断增加，影响了色原酮提取量的继续升高。因此选择45 min左右进行正交实验。

　　2.2.3   超声频率提取率的影响在料液比1∶30 ,其它条件相同下选择超声频率30，50，70，90 kHz进行超声萃取 ,结果总色原酮质量分数分别为0.905 1%，0.974 4%，1.008%，1.014 4%。随着超声频率的增加 ,总色原酮的提取率不断增加 ,考虑超声波仪器本身的频率限制 ,故将频率定为70 kHz左右。

　　2.2.4  提取温度温度过高杂质溶出增加; 温度过低 ,影响色原酮在甲醇的溶出。因此，综合考虑 ,选择30，40，50℃进行正交实验。

　　2.3  正交实验设计及个因素水平设置 根据单因素实验结果 ,选取料液比(A)、超声时间(B)、超声温度(C)和超声频率(D)为主要考察因素 ,各因素及水平设置见表1。正交实验采用4因素3水平正交表即L9 (34) 正交表进行实验 ,结果见表2 ,并对4种色原酮总量进行极差分析及方差分析。结果见表3～4。

　　表1  因素水平（略）

　　以总色原酮为考察指标 ,极差R值大小显示因素作用主次分别为C>D>B>A; 即提取温度C的极差值最大 ,表明提取温度是影响超声波萃取的最重要因素。方差分析结果(表4)表明，C、D因素对防风中色原酮的提取影响达到极显著水平(P<0.01)。B因素对防风中色原酮的提取影响达到显著水平(P< 0.05)。其最适宜的提取工艺组合为A2B2C3D3 ,即料液比为1∶30 ,超声时间45 min ,超声温度50 ℃ ,超声频率90 kHz。

　　2.4   验证实验根据以上所选最佳工艺 A2B2C3D3的条件 ,对防风样品中色原酮类成分的含量进行测定 ,结果总色原酮质量分数为1.089 4% ,1.092 7% ,1.093 8% ,平均值为1.092% ,大于正交设计中的含量 ,所得结果正确 ,并且具有良好的重复性和较高的准确率 ,所筛选的提取工艺条件基本稳定 ,可作为防风中色原酮化合物的测定方法。

　　表2  提取工艺正交设计实验结果（略）

　　表3  极差分析（略）

　　表4  方差分析（略）

　　3  讨论
    
　　实验曾使用不同浓度的乙醇进行提取 ,但水溶性杂质也一起萃取出来 ,干扰了4种色原酮的HPLC检测 ,而用甲醇提取时水溶性杂质少 ,故本实验选用甲醇作为提取溶剂。
   
　　实验结果表明，提取温度和超声频率对提取效果有极显著的影响。分析原因认为适度增加温度有利于提高溶剂的溶解度，但温度过高导致溶剂挥发严重，杂质溶出增加；而高频率的超声波可产生强烈震动和空化效应，从而加速植物材料中有效成分的溶出。
   
　　通过单因素和L9 (34) 正交实验 ，确定防风4种色原酮超声波提取最佳工艺为：料液比为1∶30 ，超声时间45 min，超声温度50 ℃ ，超声频率90 kHz，其结果经验证实验确认条件可行。该法具有实验设备简单，操作方便，提取时间短，提取效率高等优点。作为中药提取新工艺，具有良好的应用前景和实际的指导意义。

【】
  ［1］ 国家药典委员会. 药典，Ⅰ部［S］. 北京：化学出版社，2005: 102.

　　［2］ 张贵君，张燕波，李 影. 我国生药防风近10年的研究概况［J］. 时珍国药研究, 1997, 8(1): 73.

　　［3］ 王林丽，宋志勇. 防风的研究进展［J］. 中国药业, 2006, 15(10): 63.

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　　［5］ 张晓东，潘国凤，吕圭源. 超声提取在中药化学成分提取中的应用研究进展［J］. 时珍国医国药, 2004, 15(12): 861.

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